[发明专利]猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括扩增非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的4个基因位点的特异性引物及荧光探针。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)将多重荧光定量PCR扩增技术与冷冻干燥技术进行结合，实现单样品多指标同时检测，该系统简化了实验操作步骤、提高了检测通量，为猪烈性传染病病原体多指标精准检测提供了新方法，满足多指标快速筛查及精准检测的迫切需求；(2)检测过程中检测区完全相互隔离和密闭，检测完成后，密封试剂固化，有效防止整个检测过程和检测结束后扩增产物向外扩散，防止环境污染。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及猪4种传染病病原体的检测，具体为猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒及其应用。

背景技术

猪急性、烈性传染病，其传染性、发病性极强，死亡率极高。如非洲猪瘟、猪瘟、口蹄疫、丹毒、肺疫等重大疫病。

猪烈性传染病对猪养殖业构成了严重威胁，如非洲猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、经典猪瘟和猪伪狂犬等烈性传染病对养猪业构成了很大威胁，也给养猪业造成了严重的经济损失。猪烈性传染病具有高度传染性、发病率和致死性，与其它非烈性传染病临床症状相似，临床症状不易区分，并且常与其它病原体混合感染，这都给临床诊断带来很大的麻烦。目前实验室诊断方法主要有病原体直接涂片镜检观察、细胞培养检查、血清酶联免疫学检测和核酸检测技术，其中镜检和培养法的特异性最好，但灵敏度较差，对样本的采集、保存、运输和实验条件要求高，检测周期长，部分病原体极难培养、无法质控，对混合感染检出率低；而免疫学检测灵敏度低，而且病原体感染具有窗口期，对于发病急、死亡率高的猪烈性传染病诊断价值不大。核酸检测技术由于其高灵敏度和特异性已越来越广泛地应用于猪病相关病原体的检测，但较低的检测通量以及检测试剂需要冷链运输及低温保存等问题限制了其在病原微生物方面的应用。因此，以上方法在实际应用中均存在一定的局限性。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，实现单样品多指标同时检测，简化实验操作步骤、提高检测通量，以满足多指标快速筛查及精准检测的迫切需求，真正实现“样本进、结果出”的一体化检测流程；鉴于此，本发明提供了猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒及其应用。

技术方案：猪烈性传染病病原体多联检测试剂盒，所述试剂盒包括扩增非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、经典猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的4个基因位点的特异性引物及荧光探针；其中，4个基因位点为：非洲猪瘟病毒的VP72基因，猪繁殖与呼吸道综合征病毒的N基因，经典猪瘟病毒的5’UTR基因，猪伪狂犬病毒的gD基因；以及猪内参基因ACTB的特异性引物和荧光探针。

优选的，所述特异性引物及荧光探针序列如下：ASFV、SEQ ID NO.1-3；PRRSV、SEQID NO.4-6；CSFV、SEQ ID NO.7-9；PRV、SEQ ID NO.10-12；Sus、SEQ ID NO.13-15。

表1特异性引物及荧光探针序列表

优选的，所述试剂盒包含PCR反应液Ⅰ和PCR反应液Ⅱ；其中，PCR反应液Ⅰ包括SEQID NO.1-2、SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.13-14所示的特异性引物，以及SEQ ID NO.3、SEQID NO.6和SEQ ID NO.15所示的荧光探针；PCR反应液Ⅱ包括SEQ ID NO.7-8、SEQ IDNO.10-11所示的特异性引物，以及SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12所示的荧光探针。