[发明专利]guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用。本发明利用原核表达载体pET28a(+)构建固氮菌GXGL‑4A的guaA基因表达载体，将其转化至野生株GXGL‑4A，获得阳性转化株，该菌株在培养时通过添加微量的IPTG诱导，即可高表达嗜铁素。现有技术相比，本发明通过表达固氮菌自身基因组中的guaA基因就能显著提高该菌嗜铁素产率，所得到的转化株可以用作植物促生菌，在原有能固氮的基础上增加对土壤中铁的吸收，帮助植物根系从土壤等环境中获取更多的铁元素，增强植株长势，同时竞争土壤中病原菌的铁营养，帮助植物提高抗病性。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用。

背景技术

铁元素是生物生长发育的必需营养元素，参与多种酶的合成和生命体代谢功能的发挥，如细胞色素氧化酶、铁氧还蛋白、固氮酶等。铁在地壳中含量较高，但大部分形态不可被生物直接利用。有些植物根际促生菌能分泌可以与铁离子高效结合的小分子物质，称为嗜铁素。在缺铁的情况下，这些细菌就可以通过产生嗜铁素鳌合土壤中有限的Fe³⁺，供给植物和自身的生长发育，此时使环境中的铁浓度被降低，病原微生物由于缺铁生长受限制甚至死亡。细菌嗜铁素与生物防治能力密切相关，提高植物促生菌如固氮菌等的嗜铁素合成能力有助于将这些菌改造成高络合铁的菌剂用于农业生产，提高作物产量和对病害的抗性。

由于病原微生物自身不能产生嗜铁素或产生量很少，在这种竞争作用下，病原微生物因铁缺乏而不能生长繁殖。除此之外，嗜铁素还可与其他金属元素形成螯合物，促进植物对Al³⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺金属元素等的富集，大量的科研资料证实嗜铁素在促进植物生长发育、提高植物的抗逆性等方面发挥至关重要的作用。

对非豆科植物来源的联合固氮菌进行遗传改造以扩大其应用范围是近年来微生物固氮领域的研究热点。由于固氮菌自身具有很好的生物固氮能力，如果再进一步提高其产嗜铁素能力，就可以将固氮菌改造成为理想的植物生长促生菌，提高作物对土壤缺铁逆境的适应能力，并有效抑制土壤中的病原菌，提高植株健康水平，减少农药和化学氮肥的使用量，最终达到保护环境，实现农作物优质的绿色高效生产。而传统的提高细菌嗜铁素产率的思路局限于通过优化细菌培养条件，如最适发酵时间、起始pH值、接种量、装液量及Fe³⁺浓度等来获得最高产量的嗜铁素。方法复杂，影响因素多，操作不方便，在实际应用中很难推广，不实用，因而在拮抗菌株的抑菌活性开发及生防杀菌剂的创制中效果并不理想。为了能更好地利用包括固氮菌在内的植物促生菌，将之开发成多功能的生物菌剂，需要新思路和方法。

核苷酸的从头合成是由简单的前体小分子物质(磷酸核糖，CO₂，氨基酸等)先经过11步反应合成次黄嘌呤核苷酸(inosine monophosphate IMP)，再由IMP通过不同代谢途径生成AMP和GMP(guanosine monophosphate，GMP)。GMP的生成首先需要IMP在IMP脱氢酶的催化下，生成黄嘌呤核苷酸(xanthosine monophosphate，XMP)，XPM再由guaA基因合成的GMP合成酶(GMPS)催化生成GMP。GMP对DNA和RNA的合成至关重要。此外，GMP合成酶催化生成GMP过程中产生的GTP参与了许多与细菌细胞分裂有关的生理活动。guaA基因在GMP最终生成中起关键作用，该基因和细胞分裂有关，且主要作用于XPM生成GMP的过程。利用过表达guaA基因来调控细菌嗜铁素的合成，从而达到高产嗜铁素的目的，这方面的研究尚未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用。本发明可以很方便地获得高产细菌嗜铁素的转化子。这种方法适用于所有产嗜铁素的植物促生菌，如固氮菌、植物根际促生菌等，可方便地实现靶基因guaA的高表达，依靠其调控嗜铁素的高合成，操作简单有效。本发明的方法也适用于其他产嗜铁素细菌的遗传操作，通过遗传转化快速构建高产嗜铁素的转化株，迅速用于农业生产等。