[发明专利]一种沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法

说明书

本发明提供了一种沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，涉及植物基因功能研究技术领域；所述方法包括以下步骤：用高渗溶液对连翘幼果预处理；将目的基因构建入pTRV2，得重组载体pTRV2:FsTG，转化入根癌农杆菌获得重组农杆菌，与基础侵染液混合，得转化有pTRV2:FsTG的重组农杆菌侵染液；将载体pTRV1与根癌农杆菌混合培养，得重组农杆菌，与基础侵染液混合，得转化有pTRV1的重组农杆菌侵染液；将两种侵染液混合制备转化液；将预处理后的连翘幼果放入转化液中振荡培养2～3周。在连翘幼果中通过转录后基因沉默的方式将连翘果实中的基因沉默，使其表达量降低，为连翘果实病毒诱导基因沉默体系构建奠定基础。

技术领域

本发明涉及植物基因功能研究技术领域，尤其涉及一种沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法。

背景技术

在传统的基因功能研究方法中，对植物物种构建稳定的植物突变体系，对于研究基因功能是必要的。在此过程中，首先需要对待转基因植物进行植物组织培养，在愈伤组织时期使用农杆菌将不同的转基因载体转化入植物细胞，主要包括稳定表达载体，以CRISPR-Cas9为主的基因编辑载体等，或者使用物化处理方法使植物产生基因突变等。目前，只有拟南芥以及烟草和其它的一些植物物种才可以产生稳定的植物转化体系。对于多年生植物来说相对较难，因为大多数多年生植物转化效率偏低、并且多年生的特性使得植物组织培养时间较长，成本高、某些表型具有滞后性，例如生殖器官的某些表型，需要植物较为漫长营养期结束进入生殖期后才可观察到，可见传统的通过改变基因组信息的方式并不适合研究多年生植物。目前存在通过改变转录水平的基因功能研究方法，常见的有RNA干扰(RNAi)、人工microRNA介导的基因沉默等，但是它们只适合转化效率较高的植物，且都需要稳定的植物转化，既费时又不适合高通量研究，所以目前适用于多年生植物基因功能研究的方法极少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，在连翘幼果中通过转录后基因沉默的方式将连翘果实中的基因沉默，使其表达量降低，为连翘果实病毒诱导基因沉默体系构建奠定基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，包括以下步骤：

用高渗溶液对连翘幼果预处理；

将待检测的目的基因构建入烟草脆裂病毒第二亚基因组，得重组载体pTRV2:FsTG；将所述重组载体转化入根癌农杆菌获得转化有pTRV2:FsTG的重组农杆菌；将转化有pTRV2:FsTG的重组农杆菌的菌体与基础侵染液混合，得转化有pTRV2:FsTG的农杆菌侵染液；

将烟草脆裂病毒第一亚基因组载体pTRV1与根癌农杆菌混合振荡培养；获得转化有pTRV1的重组农杆菌；将转化有pTRV1的重组农杆菌的菌体与基础侵染液混合，得转化有pTRV1的重组农杆菌侵染液；

将转化有pTRV1的重组农杆菌侵染液与转化有pTRV2:FsTG的重组农杆菌侵染液混合制备转化液；

将预处理后的连翘幼果放入转化液中振荡培养2～3周。

优选的，所述高渗溶液为包括20～30％(w/v)蔗糖的1/2Ms溶液；所述高渗溶液的pH为5.5～6.5；所述预处理的时间为3～7h。

优选的，所述目标基因为连翘番茄红素去饱和酶基因，所述连翘番茄红素去饱和酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

优选的，所述pTRV1与农杆菌GV3101振荡培养的培养基为LB培养基，添加40～60mg/L卡那霉素和40～60mg/L利福平。

优选的，所述烟草脆裂病毒第一亚基因组载体pTRV1与农杆菌GV3101振荡培养的温度为26～30℃，时间为8～16h，转速为200～240rpm。