[发明专利]一种沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法

权利要求书

1.一种沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用高渗溶液对连翘幼果预处理；

将待检测的目的基因构建入烟草脆裂病毒第二亚基因组，得重组载体pTRV2:FsTG；将所述重组载体转化入根癌农杆菌获得转化有pTRV2:FsTG的重组农杆菌；将转化有pTRV2:FsTG的重组农杆菌的菌体与基础侵染液混合，得转化有pTRV2:FsTG的农杆菌侵染液；

将烟草脆裂病毒第一亚基因组载体pTRV1与根癌农杆菌混合振荡培养；获得转化有pTRV1的重组农杆菌；将转化有pTRV1的重组农杆菌的菌体与基础侵染液混合，得转化有pTRV1的重组农杆菌侵染液；

将转化有pTRV1的重组农杆菌侵染液与转化有pTRV2:FsTG的重组农杆菌侵染液混合制备转化液；

将预处理后的连翘幼果放入转化液中振荡培养2～3周。

2.如权利要求1所述沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，所述高渗溶液为包括20～30％(w/v)蔗糖的1/2Ms溶液；所述高渗溶液的pH为5.5～6.5；所述预处理的时间为3～7h。

3.如权利要求1所述沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，所述目标基因为连翘番茄红素去饱和酶基因，所述连翘番茄红素去饱和酶基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。

4.如权利要求1所述沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，pTRV1与农杆菌GV3101振荡培养的培养基为LB培养基，添加40～60mg/L卡那霉素和40～60mg/L利福平。

5.如权利要求4所述沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，烟草脆裂病毒第一亚基因组载体pTRV1与农杆菌GV3101振荡培养的温度为26～30℃，时间为8～16h，转速为200～240rpm。

6.如权利要求1所述沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，所述基础侵染液为包括有90～110μM乙酰丁香酮、65～85μMTriton-X100和1.5～3.5％(w/v)蔗糖的1/2Ms培养基。

7.如权利要求1所述沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，转化有pTRV1的农杆菌侵染液与转化有pTRV2:FsTG的农杆菌侵染液的OD₆₀₀独立为0.05～0.15。

8.如权利要求1所述沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，转化有pTRV1的农杆菌侵染液与转化有pTRV2:FsTG的农杆菌侵染液的混合体积比为1:1～2。

9.如权利要求1所沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，连翘高渗溶液预处理幼果放入转化液振荡培养的温度为19～23℃，相对湿度为45～60％，转速为40～80rpm。

10.如权利要求9所述沉默或敲低连翘幼果中基因表达的方法，其特征在于，连翘高渗溶液预处理幼果放入转化液振荡培养的日照周期为光照14～18h，黑暗6～10h，光照强度为350～450μmol/m²·s。