[发明专利]一种烟酰胺核糖激酶基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种烟酰胺核糖激酶基因工程菌及其在合成β‑烟酰胺单核苷酸中的应用，所述工程菌是将烟酰胺核糖激酶基因转入宿主菌构建获得；所述烟酰胺核糖激酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所获得的烟酰胺核糖激酶基因工程菌在烟酰胺核糖激酶及多聚磷酸激酶投入量保持不变的情况下，反应总时长为2小时，经HPLC测定，合成β‑烟酰胺单核苷酸的最大浓度达到86.9g/L，底物烟酰胺核糖氯化物的转化率达到94％以上，为当前已知的最高生产水平。

(一)技术领域

本发明涉及一种来源于棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NRK)基因工程菌的构建及其在合成β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

(二)背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononuclotide，NMN)，是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)合成途径的重要中间体。近年研究证明，NMN具有显著的抗衰老功能，因而以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景，在日本和美国均有相关的保健品上市销售。

传统的NMN的生产是采用化学合成，以烟酰胺核糖(NR)为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到。总体收率很低；同时有机溶剂使用量大，环境污染严重，因而，目前NMN主要采用生物酶法来制备。

NMN的生物酶法制备主要有两条途径：第一条是以D-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN；该条路线底物转化率不高(以烟酰胺计算，最高不超过50％)，且中间产物较多，后续分离纯化较困难，因而总体收率偏低，导致生产成本高。而且制备途径用到的原料中，D-核糖和烟酰胺性质不稳定，价格昂贵；烟酰胺也不是常用工业原料，不易购买，需要另行化学合成，以及烟酰胺核糖激酶(NRK)单酶催化效率低，这些因素的存在不利于NMN高效环保的大规模生产。

第二条路线是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NRK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN，收率高，产品纯度高。但是反应时间过长，副产物多仍是一个限制因素。最重要的是，烟酰胺核糖激酶活较低，仍需要进一步提高。鉴于此，寻找新的NRK酶来进一步提高β-烟酰胺单核苷酸的生产能力具有重大的意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高效合成β-烟酰胺单核苷酸的烟酰胺核糖激酶基因工程菌及其在合成β-烟酰胺单核苷酸中的应用，有效提高了β-烟酰胺单核苷酸的产量。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种烟酰胺核糖激酶基因工程菌，所述工程菌是将来源于棘孢木霉(Trichoderma asperellum，bio-40993，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的烟酰胺核糖激酶基因转入宿主菌构建获得；所述烟酰胺核糖激酶基因核苷酸序列如SEQID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述宿主菌可以选用大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。

进一步，所述工程菌按如下步骤构建：将烟酰胺核糖激酶基因经限制性内切酶BamH I和Hind III酶切后，与同样经限制性内切酶酶切后的pET-28a(+)质粒连接，再转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选获得烟酰胺核糖激酶基因工程菌。