[发明专利]一种烟酰胺核糖激酶基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一种烟酰胺核糖激酶基因工程菌，其特征在于所述工程菌是将来源于棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的烟酰胺核糖激酶基因转入宿主菌构建获得；所述烟酰胺核糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述烟酰胺核糖激酶基因工程菌，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

3.如权利要求1所述烟酰胺核糖激酶基因工程菌，其特征在于所述工程菌按如下步骤构建：将烟酰胺核糖激酶基因经限制性内切酶BamH I和Hind III酶切后，与同样经限制性内切酶酶切后的pET-28a(+)质粒连接，再转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选获得烟酰胺核糖激酶基因工程菌。

4.一种权利要求1烟酰胺核糖激酶基因工程菌在合成β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用为：以烟酰胺核糖激酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎后的破碎混合液为催化剂，以多聚磷酸激酶为ATP再生辅酶，以烟酰胺核糖氯化物和三磷酸腺苷为底物，以六偏磷酸钠为ATP再生体，以六水氯化镁为激酶激活剂，以纯化水为反应介质构成转化体系，调节pH至6.5-6.8，在20℃-30℃下进行催化反应，反应结束后反应液经分离纯化得到β-烟酰胺单核苷酸。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述转化体系中，催化剂加入量以破碎前湿菌体重量计为1-5g/L；所述烟酰胺核糖氯化物加入量为20-100g/L；所述三磷酸腺苷加入量为4.5-5.5g/L；所述六偏磷酸钠加入量为28-35g/L；所述六水氯化镁加入量为5-5.8g/L。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述多聚磷酸激酶以多聚磷酸激酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎后的破碎混合液形式加入，所述多聚磷酸激酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述多聚磷酸激酶加入量以破碎前湿菌体重量计为1-5g/L。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将烟酰胺核糖激酶基因工程菌接种于LB培养基中，37℃过夜培养，用新鲜LB培养基稀释至OD₆₀₀为0.1；继续37℃培养2小时至OD₆₀₀为0.8后，添加终浓度0.3mM的IPTG，25℃诱导培养10小时后，离心，收集湿菌体用纯化水重悬后超声破碎细胞，收集破碎混合液；超声破碎细胞程序为：工作4s，停3s，250W，超声99次循环。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述湿菌体采用发酵罐制备：将烟酰胺核糖激酶基因工程菌接种于LB培养液中，37℃过夜培养，获得种子液；将种子液以体积浓度5％接种量转移到装有发酵培养基的发酵罐中，设定温度37℃，搅拌速度800rpm，溶氧≥30％，进气量1.2vvm，罐压0.03～0.04MPa，开始发酵，过程中氨水控制pH6.8～6.9；待OD600达到25时，开始降温至25～26℃，加入终浓度0.3mM的IPTG，诱导表达14～16h，发酵液离心，收集湿菌体；所述发酵培养基组成：12g/L蛋白胨，14g/L酵母膏，5g/L无水甘油，2g/L KH₂PO₄，16g/LK₂HPO₄·3H₂O，溶剂为水，pH6.5-6.8。

10.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应过程中，当烟酰胺核糖氯化物残留量低于6g/L时，再投加20-40g/L的烟酰胺核糖氯化物，调控pH6.5～6.8继续反应，重复操作至产物β-烟酰胺单核苷酸达到80-90g/L。