[发明专利]核酸的检测

说明书

本发明涉及核酸的检测。本文提供了与检测和鉴别核酸有关的技术，且具体地，但是非排它地，涉及用于在单分子分辨率以高可靠性检测、鉴别和定量靶核酸的组合物、方法、试剂盒和系统。

本申请是国际申请日为2017年2月8日的国际申请PCT/US2017/016977进入中国、申请号为201780020624.1的题为“核酸的检测”的发明专利申请的分案申请。本申请要求2016年2月10日提交的美国临时专利申请系列号62/293,589的优先权，其通过引用整体并入本文。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明在美国国立卫生研究院（U.S. National Institutes of Health）颁布的授权GM062357下和在美国海军海军研究办公室（U.S. Navy, Office of Naval Research）颁布的授权W911NF-12-1-0420下在政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本文提供了与检测和鉴别核酸有关的技术，且具体地，但是非排它地，涉及用于在单分子分辨率以高可靠性检测、鉴别和定量靶核酸的组合物、方法、试剂盒和系统。

背景技术

早期检测对于许多疾病（特别是癌症）的有效治疗而言是关键性的。与鉴别早期阶段疾病的相关可检测生物标志物有关的研究已经指出，核酸会提供癌症和其它病的高度特异性的生物标志物。例如，最近癌细胞衍生的双链DNA (dsDNA)与二级结构化的长非编码RNA (lncRNA)一起已经作为癌症和其它疾病的灵敏的和特异性的生物标志物出现在天然的人生物流体（诸如血液、尿和痰）中。

尽管它们有希望成为诊断生物标志物，但是，核酸生物标志物的灵敏的和特异性的检测已经证实是挑战性的。具体地，用于检测核酸的现有技术利用这样的探针：其与靶分子形成热力学上稳定的复合物且因而受限于与背景信号、假靶标或密切相关的突变体核酸的弱的和经常不可靠的热力学区分。另外，互补DNA或RNA链在样品中的存在严重地限制了靶序列的可达性。

因而，需要无扩增地检测在最低程度上处理的天然生物流体中的核酸的灵敏的和特异性的测定以提供快速的和可靠的核酸生物标志物的鉴别和/或定量。

发明内容

因此，本文提供了特异性的和超灵敏的单个核酸(例如，dsDNA、lncRNA、甲基化的DNA等)靶分子的检测和计数的技术，其基于短的经标记的探针与靶核酸的短暂结合。在某些实施方案中，通过由探针-靶标相互作用产生的动力学“指纹”信号来检测靶核酸。该具有平衡泊松取样的单分子识别(Single-Molecule Recognition with Equilibrium PoissonSampling，SiMREPS)技术提供了单链核酸(参见，例如，美国专利申请系列号14/589,467,通过引用整体并入本文)和双链核酸的灵敏检测。在某些实施方案中，双链核酸的检测包括dCas9-引导的捕获和DNA解链的应用。在某些实施方案中，该技术包括使用负载指导RNA(gRNA)的、无催化活性的(“死的”) dCas9酶或以高特异性结合靶核酸的一个或多个区段的酶将未标记的靶标捕获在玻璃或熔化的二氧化硅表面上。在某些实施方案(例如，用于检测lncRNA)中，所述技术进一步包括使用前间区序列邻近基序(PAM)寡核苷酸来提供核酸靶标(例如，lncRNA)的dCas9靶向。

在某些实施方案中，所述技术包括使用分子内SiMREPS探针，例如，捕获探针和查询探针，它们被连接以提供分子内探查机制(参见，例如，图5 a和b；参见下文)。