[发明专利]一种节约脐带间充质干细胞培养工序的培养方法

权利要求书

1.一种节约脐带间充质干细胞培养工序的培养方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)脐带获取；

(2)华通氏胶获取；

(3)剪碎：将剥离的华通氏胶剪成1～3mm³的组织块；

(4)铺瓶：将移液枪枪头前段剪断，用去前段的移液枪枪头将组织块转入到T175细胞培养瓶中，每个培养瓶加入20ml原代培养液，置于培养箱中静置培养；

(5)传代或冻存：显微镜下观察每个培养瓶约10个组织块爬出细胞，每个集落融合度80％-90％时进行消化传代或冻存，消化下来的细胞进行计数后，结果未到达冻存要求，按照不少于4000个/cm²密度接种至新的培养瓶中，置于培养箱中静置培养，若计数结果达到冻存要求则按5×10⁶个/ml进行冻存。

2.根据权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，脐带获取步骤：获取脐带后，首先应剪去质量不好的部分并进行多次洗涤。

3.根据权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，华通氏胶获取步骤：需要先剥离脐带中的1根静脉和2根动脉，其目的是提高脐带间充质干细胞纯度。。

4.根据权利要求3的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，华通氏胶获取步骤：使用带齿镊固定脐带，用组织镊将华通氏胶撕下，先将华通氏胶放入50ml离心管中，加入清洗液上下翻动漂洗一次，然后华通氏胶移入新的50ml离心管中，补加清洗液至终体积50ml；最后将装有华通氏胶的离心管放入离心机中并配平，设置离心机转速为270g，离心时间5min，离心结束，弃上清液。

5.根据权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，移液枪枪头前段需要剪断1cm尺寸。

6.根据权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤(4)和(5)中，置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养。

7.根据权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述移液枪的规格选择1000ul的移液枪。

8.根据权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述T175细胞培养瓶是指一种表面经过特殊处理，培养面积为175cm²，瓶盖为带滤芯的用于贴壁细培养的无菌培养瓶。

9.根据权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤(4)中，原代培养液组成：含10％人血小板裂解液和0.15％硫酸庆大霉素的DMEM/F12(酚红)培养基。

10.根据权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤(5)中，新的培养瓶指未使用的与步骤(4)中所述的T175培养瓶相同的无菌培养瓶。