[发明专利]一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法

说明书

本发明提供了一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法，属于免疫细胞治疗技术领域。本发明的方法包括：携带抑制免疫负调控基因siSOCS1及CA9目的基因的rAAV2‑siSOCS1‑CA9重组病毒载体的制备；单个核细胞中DC细胞的分离与培养；rAAV2‑siSOCS1‑CA9重组病毒载体感染，诱导DC细胞成熟，得iAPA‑CA9‑DC细胞；iAPA‑CA9‑DC细胞与T细胞混合培养，获得具有抗原特异性的iAPA‑CA9‑DC/CTL细胞，即树突状细胞激活的肾癌蛋白CA9特异性细胞毒性T淋巴细胞。本发明的方法培养扩增出大量肿瘤抗原特异性T细胞，以达到治疗癌症的目的。

技术领域

本发明属于免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法。本发明的细胞毒性T淋巴细胞是由经携带免疫负调控基因SOCS1基因及碳酸酐酶IX基因的rAAV2修饰的树突状细胞激活的，具有CA9肿瘤抗原特异性，可用于抗肾细胞癌的免疫细胞治疗。

背景技术

成人肾脏中最常见的占位性病变—肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）约占所有肿瘤2%，且在全世界范围内每年以1.5-5.9%增长。部分患者首诊时已是晚期或发生远端转移，且肾癌具有多重耐药基因对放疗、化疗不敏感，愈后较差，中位生存时间12个月，5年生存率10%。目前，手术切除是最好的治疗方法，但棘手的是，微小和转移病灶难以手术切除，术后患者复发率高达20%-40%；此外，部分患者采用IL-2，IFN-α等细胞因子治疗有效，但药物的毒性作用十分明显。

RCC的发生、发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关。特别是RCC患者到了晚期，患者体液免疫与细胞免疫功能普遍低下，RCC细胞无法被T细胞识别、杀伤。由于荷瘤宿主的树突状细胞（dendritic cell, DC）数量少，无法有效递呈RCC抗原，且RCC细胞分泌VEGF、IL-10、TGF-β、PGE2等细胞因子和粘附分子，使树突状细胞的成熟分化停留在幼稚阶段或向其他内皮细胞转化，MHC-II类分子及某些共刺激分子的低表达，从而使得 DC严重降低甚至失去其抗原递呈及激活T细胞的能力。

目前体外实验证实，分离患者外周血的淋巴细胞对多种外来抗原具有很好的反应能力。因此肿瘤过继性免疫细胞疗法（DC/CTL）有望成为较好的RCC治疗方法，其作用机制是DC体外荷载RCC抗原，并通过MHC/抗原肽-TCR的相互作用激活特异性CTL，回输机体启动抗RCC免疫应答，清除RCC。目前常采用肿瘤细胞裂解物负载DC，但其有不足，非肿瘤相关抗原种类多，易诱发自身免疫病，且多抗原亦导致免疫原性低；另一种刺激诱导物采用肿瘤抗原肽致敏DC，其特异性好，可多次免疫，但也存在不足，抗原肽价格一般较贵、半衰期短，需多次免疫才能获得良好的CTL。

对于负载DC的研究日渐深入，研究人员发现通过制备转基因DC并体外诱导CTL，可促进CTL充分发挥抗肿瘤作用。与肿瘤全抗原、抗原裂解物相比，肿瘤转基因制备的DC/CTL特异性更好，抗肿瘤免疫反应更强；与肿瘤抗原肽相比，肿瘤转基因可持续表达，有效降低DC/CTL制备成本。目前rAAV因具有感染能力强、安全性好、免疫源性低和体内长时间表达外源基因等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。基于DC的肿瘤细胞靶向治疗技术（anti-cancer cellularimmunotherapy, ACTL）是通过基因重组改建为携带特定肿瘤相关抗原决定簇基因的rAAV转导DC，刺激产生特异性杀伤肿瘤细胞的CTL。研究表明，CTL反应能力方面，带抗原的rAAV优于蛋白质负荷，其转染DC效率高达90%以上，且具有上调DC的功能。