[发明专利]一种肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法

权利要求书

1.肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）携带siSOCS1及CA9目的基因的rAAV2-siSOCS1-CA9重组病毒载体的制备；

（2）rAAV2-siSOCS1-CA9重组病毒载体感染、分化、诱导DC细胞成熟，得iAPA-CA9-DC细胞；

（3）iAPA-CA9-DC细胞与T细胞混合培养，获得iAPA-CA9-DC/CTL细胞，即肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：步骤（1）中所述携带目siSOCS1及CA9的目的基因序列依次为：U6启动子序列、SOCS1 siRNA序列、SOCS1 siRNA反向序列、CMV启动子序列、CA9蛋白基因序列、IRES序列、Flagellin鞭毛蛋白基因序列；所述SOCS1 siRNA序列如SEQ ID NO.1所示，SOCS1 siRNA反向序列如SEQ ID NO.2所示，SOCS1 siRNA序列和SOCS1siRNA反向序列，两段序列反向互补；目的基因与2型腺相关病毒载体AAV2组装获得rAAV2-siSOCS1-CA9重组病毒载体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述rAAV2-siSOCS1-CA9重组病毒载体感染、分化、诱导DC细胞成熟中，按照MOI 100进行rAAV2-siSOCS1-CA9重组病毒载体感染DC细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，iAPA-CA9-DC细胞与T细胞混合培养的，包括以下具体步骤：

1）加入刺激因子CD₃单抗50 ng/ml，CD₂₈单抗50 ng/mL，IL-2 1000 U/mL，刺激T细胞增殖；

2）T细胞刺激增殖培养48h后，iAPA-CA9-DC细胞与T细胞按1:5的比例混合培养，调整细胞密度为1×10⁶ cell/mL，添加1000 U/mL IL2的KBM581培养基；获得iAPA-CA9-DC/CTL细胞。

5.一种权利要求1所述方法制备的肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞。

6.一种包含权利要求5所述肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的癌症治疗药物。

7.权利要求5所述肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞在非疾病诊断、治疗生物领域的应用。

8.权利要求6所述包含肾癌抗原CA9蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞的癌症治疗药物在非疾病诊断、治疗生物领域的应用。