[发明专利]一种高产α-蛇麻烯的酵母重组菌株的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高产α‑蛇麻烯的酵母重组菌株的构建方法及其应用，属于代谢工程领域。本发明通过在热带假丝酵母的染色体DNA上整合表达植物来源的α‑蛇麻烯合酶基因构建了可以合成α‑蛇麻烯的工程菌株，在此基础上过表达内源性的涉及α‑蛇麻烯合成基因，构建高效生产α‑蛇麻烯的重组菌株，α‑蛇麻烯产量达到149.7mg·Lsupgt;‑1/supgt;，较对照菌株提高了112倍。本发明还提供了利用上述工程菌株生产α‑蛇麻烯方法。本发明提供的α‑蛇麻烯生产菌株生产性能稳定，生产过程不需要添加抗生素，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及一种高产α-蛇麻烯的酵母重组菌株的构建方法及其应用，属于代谢工程领域。

背景技术

α-蛇麻烯，又称α-石竹烯或葎草烯，是一种广泛存在于葎草科植物中的单环萜烯。研究表明蛇麻烯具有减轻炎症、缓解疼痛的作用，可有效防止引起感冒、肺炎等呼吸道疾病的病毒侵入人体，并且在抗癌方面极具潜力。另一方面，蛇麻烯气味特别，还可以做驱虫剂使用。此外，蛇麻烯还是多种萜烯和萜类生物碱生物合成的基本骨架，可以利用蛇麻烯为原料生产多种高附加值产品。

由于植物生长周期长，α-蛇麻烯含量受生长环境和气候影响较大，且植物中α-蛇麻烯含量较低，所以从植物原料中提取α-蛇麻烯难度较大，且提取成本很高。随着生物科学与技术的发展，目前已经解析出植物的α-蛇麻烯合成途径，但是利用植物组织提取法大规模生产α-蛇麻烯依然困难。一方面由于植物的代谢途径复杂，遗传改造难度大，另一方面环境因素对植物中α-蛇麻烯含量影响很大，不利于工业化生产。因此，利用微生物具有生长旺、繁殖快、易于大规模培养等特点，通过合成生物学手段改造合适的微生物细胞高效生产α-蛇麻烯具有很大的前景和意义。

因此，得到一株能够适用于生产的高效合成α-蛇麻烯的菌株对工业生产具有重要的意义。

发明内容

热带假丝酵母是一种二倍体非常规酵母，其细胞内具有合成萜类前体物的高活性代谢途径，是极具潜力的可用于生产α-蛇麻烯的工业菌株，但是，热带假丝酵母本身不具有合成α-蛇麻烯的完整途径。因此，为解决上述问题，本发明通过基因工程手段系统构建高效生产α-蛇麻烯的工程菌株，显著增加α-蛇麻烯的产量，提高其合成效率，促进其在医药化工等领域中的应用。

本发明提供了一种合成蛇麻烯的基因表达盒，所述基因表达盒自上游至下游依次包括一个或多个“启动子-目的基因-转录终止子”结构单元；

其中目的基因包括：

蛇麻烯合酶基因ZSS1、HMG-CoA还原酶基因NADH-HMGR、乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、HMG-CoA合成酶基因ERG13、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、二磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG19、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1和香叶基/法尼基焦磷酸合酶基因ERG20。

在本发明的一种实施方式中，所述表达盒包括：

采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ZSS1基因，记为表达盒ZSS1；

采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ZSS1基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG20基因，记为表达盒ZSS1-ERG20；

采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达IDI1基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ERG19基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG8基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG12基因，记为表达盒ERG12-ERG8-ERG19-IDI1；