[发明专利]一种非侵入性快速确定植物是否感染番茄黄化曲叶病毒的方法

说明书

本发明涉及植物病害防治领域，本发明采用通过媒介昆虫分泌的蜜露来确定植物是否被病毒番茄黄化曲叶病毒感染的方法，可以有效的减少传统检测方法的工作量，同时避免了植物早期感染番茄黄化曲叶病毒而不易被发现的问题；通过本发明的方法可以在植物感染番茄黄化曲叶病毒的早期就发现病害，进而尽早的对病害进行防治，从而有效的抑制病害的发展和传播。

技术领域

本发明属于植物病害防治领域，具体涉及一种非侵入性快速确定植物是否感染番茄黄化曲叶病毒的方法。

背景技术

番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)侵染番茄幼苗3-4周后感染症状才比较明显，植株生长发育不良，番茄嫩叶或多或少向上卷曲，番茄幼苗感染TYLCV会导致番茄植株生长能力全部丧失，从而引起作物产量和质量的降低。

田间检测主要通过田间发病症状来鉴定植物感染TYLCV，然而田间症状的识别仅是初步的经验性判断，进一步的确定还需要对样品进行室内的分子生物学检测。当前用于TYLCV的分子生物学检测方法主要为常规PCR和荧光定量PCR，常规PCR检测较为复杂且荧光定量PCR根据标准曲线判断容易产生误差，在植株感染初期更加无法判断植株是否已经被TYLCV侵染，现有的检测方法不能满足田间的检测需求。且现有的分子生物学检测方法均需要对植物样本进行采集，因此对植物造成的伤害是不可逆转的。

烟粉虱是一种重要的植物病毒传播媒介，充当了双生病毒-番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的最主要传播者，很大程度上造成了2006年后该病毒在我国的席卷态势。烟粉虱以持久方式传播番茄黄化曲叶病毒，烟粉虱以成虫和若虫吸食植物汁液，被害叶片褪绿、变黄、萎蔫，在其吸食过程中还传播病毒。

发明内容

针对现有技术中存在的无法在番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)感染的初期获知感染情况的技术问题，本发明提供了一种非侵入性快速确定植物是否感染番茄黄化曲叶病毒的方法，包括以下步骤：

(1)使用沾有缓冲液ASL的棉签收集植物叶片上的烟粉虱蜜露并从蜜露中提取DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，加入序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物和序列为SEQ ID NO.3的探针，以及2×ddPCR Super Mix For Probes和RNase freewater，配置得到反应体系；

(3)将步骤(2)配制得到的体系和微滴生成油加入微滴发生卡中，置于微滴发生器中生成微滴；

(4)将步骤(3)中生成的微滴转移至ddPCR 96孔板进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析；

(5)对数据结果进行分析，通过copies/μL计算样品中含有的拷贝数从而得到收集样品是否感染TYLCV，当阳性液滴数大于5个时即可判断样品感染TYLCV。

在上述方案的基础上，步骤(2)中的引物序列为：5’-CCGAAAGCCCAGAATATACAGA-3’(SEQ ID NO.1)，5’-CCAGATCCACGAGTAACATCAC-3’(SEQ ID NO.2)。步骤(2)中的探针序列为：5’-CCCATGTAAAGTCCAGTCTTATGAGCAACG-3’(SEQ ID NO.3)。该探针的5’端标记有荧光基团，探针的3’端标记有淬灭基团；所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY3或JOE中的一种；所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB或DABCYL中的一种。

上述方法适用的植物包括但不限于番茄、辣椒、茄子。

本发明的上述的引物和探针同时可以作为番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)发病后的一种检测手段，该检测手段使用微滴式数字PCR技术。