[发明专利]一种新型的非核糖体多肽合成酶拆分表达方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种非核糖体多肽合成酶拆分表达方法，是根据对NRPS结构域和三维结构的预测，在特殊拆分位点以T_n‑1‑C_n‑A_n‑T_n为单元对NRPS进行拆分表达，从而将一个NRPS基因的表达转换为以拆分单元为独立基因的多基因的共表达，以高效获得相应的非核糖体多肽产物。本发明不仅可用于巨型NRPS在真菌中的异源表达，提高非核糖体多肽产量，而且为通过组合生物合成的方法进行模块间组合，合成新型的非核糖体多肽提供理论依据和途径。对于利用合成生物学进行天然非核糖体多肽的挖掘、产量的提高以及非天然非核糖体多肽的创造等方面具有较高的实际应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型的非核糖体多肽合成酶拆分表达技术。

背景技术

非核糖体多肽类天然产物是现代药物创制的重要来源，如抗真菌药物棘白菌素、免疫抑制剂类药物环孢霉素等。然而，目前利用传统的筛选技术获得具有实用价值的新型非核糖体多肽的难度越来越大。随着高通量基因组测序技术、基因合成以及多基因装配等合成生物学技术的快速发展，为通过异源生物合成技术挖掘和生产有价值的非核糖体多肽提供了途径。

非核糖体多肽类化合物的核心骨架是由模块化的非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)组装而成的。通常，NRPS是由多个模块构成的，每个模块包含三个核心功能结构域：腺苷化(adenylation，A)结构域、硫酯化(thiolation，T)结构域和缩合(condensation，C)结构域。此外，部分NRPS模块还会包含甲基化(methylation，MT)结构域、氧化(oxidation)结构域、杂环化(heterocyclization，Cy)结构域、异构化(epimerization，E)结构域等修饰结构域。在NRPS的C末端通常是负责终产物释放的硫酯酶(thioesterase，TE)结构域或末端缩合(terminal condensation，C_T)结构域。绝大多数NRPS遵循共线性装配规则，即NRPS模块的数目、种类和排列顺序与其产物中氨基酸组成单元的数目、种类和排列顺序是一致的。NRPS按照固定的逻辑逐个行使各个模块的催化功能将氨基酸单体顺序装配成特定结构的非核糖体多肽。一般来说，非核糖体多肽结构越复杂，所需要的NRPS就越大。例如，棘白菌素B含有6个氨基酸单元，其NRPS EcdA则含有6个模块，并在C末端有一个C_T结构域进行肽链的缩合环化和产物的释放，因此EcdA是由7260个氨基酸组成，其编码基因达21kb。含有11个氨基酸单元的环孢霉素A，其NRPS SimA由15228个氨基酸组成，编码基因高达45kb。我们对已测序的39个虫生真菌的基因组进行了次级代谢基因簇分析，共获得4个以上模块的NRPS基因112个，其中60％的次级代谢产物是未知的。然而，含有4个以上模块的NRPS也意味着他们的编码基因均在15kb以上。这样巨型的基因是很难扩增并通过常规的分子生物学方法进行异源表达的。

根据NRPS模块化的这种结构特点，研究者尝试以C-A、C-A-T、T-C-A或A-T-C等为交换单元进行非核糖体多肽装配线改造，在细菌NRPS中取得了成功。对于真菌NRPS结构域交换的研究则主要围绕环缩肽白僵菌素、类白僵菌素和恩镰孢菌素等的NRPS来开展。通过同源C-A-T以及C3等结构域的替换，形成的融合NRPS产生了多种新型的环缩肽类化合物。这些研究使我们看到了对巨型NRPS进行拆分表达的可能。

本发明以白僵菌素合成酶BbBEAS为模式NRPS，以结构域为节点对其进行了拆分与组合表达，通过比较其产物产量，获得了一种新型高效的双T式NRPS拆分表达技术。该发明不仅实现了巨型NRPS的拆分表达，提高了化合物产率，而且为通过组合生物合成的方法进行模块间组合，合成新型的非核糖体多肽提供了理论依据和途径。

发明内容