[发明专利]一种新型的非核糖体多肽合成酶拆分表达方法

权利要求书

1.一种NRPS拆分单元，其序列为T_n-1-C_n-A_n-T_n；其中，若为起始模块，则从起始密码子至T1为起始拆分单元；若为最后一个模块，则从前一个模块的T至终止密码子为终止拆分单元；若模块中含有甲基化结构域、杂环化结构域、异构化结构域等修饰结构域，则拆分单元中也添加相应修饰结构域；且拆分单元中结构域组成与相应模块中结构域组成一一对应；

其中T为硫酯化结构域、A为腺苷化结构域、C为缩合结构域，n为NRPS中模块的序号。

2.如权利要求1所述的NRPS拆分单元，其特征在于，其拆分的原始序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1的所述NRPS拆分单元，其特征在于，T_n-1-C_n-A_n-T_n的N端起始于A_n-1sub与T_n-1之间的linker区，C端终止于C _n+1的1~10氨基酸。

4.如权利要求1的所述NRPS拆分单元，其特征在于，所述NRPS含有两个或多个模块。

5.编码如权利要求1至4任一项所述的NRPS拆分单元的编码核苷酸序列，优选地，其原始核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.含有如权利要求5所述的编码核苷酸序列的重组菌，优选为真菌为酵母、丝状真菌，优选为酿酒酵母。

7.一种非核糖体多肽合成酶拆分表达方法，其特征在于，通过双T式NRPS拆分表达方式将一个NRPS基因的表达转换为以拆分单元为独立基因的多基因的共表达，以高效获得相应的非核糖体多肽产物，其中所述NRPS拆分单元具有下述序列：T_n-1-C_n-A_n-T_n；其中，若为起始模块，则从起始密码子至T₁为起始拆分单元；若为最后一个模块，则从前一个模块的T至终止密码子为终止拆分单元；若模块中含有甲基化结构域、杂环化结构域、异构化结构域，则拆分单元中也添加相应修饰结构域；且拆分单元中结构域组成与相应模块中结构域组成一一对应；

其中T为硫酯化结构域、A为腺苷化结构域、C为缩合结构域，n为NRPS中模块的序号。

8.如权利要求7所述的拆分表达方法，其特征在于，其拆分的原始序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

9.如权利要求7所述的拆分表达方法，其特征在于，所述拆分表达适合于NRPS在真菌中的异源表达，优选地所述真菌为酵母、丝状真菌，优选为酿酒酵母。

10.如权利要求7所述的拆分表达方法，其特征在于，

1) 根据目标NRPS的基因序列与拆分位点设计引物，并在引物末端添加相应的起始密码子、终止密码子以及载体同源片段；通过PCR对拆分单元进行扩增，进一步通过无缝克隆进行连接与克隆，获得拆分单元的表达载体；

2）通过转化将获得的表达载体转入宿主细胞中；

3）发酵检测阳性转化子，用于表达所述的非核糖体多肽。