[发明专利]一种多粘菌素A1生产菌株及其应用

说明书

本发明属于生物发酵技术领域，公开了一种多粘菌素A1生产菌株及其应用。该菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)SY20，于2021年9月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC No:61909。然后，通过对菌株进行微生物发酵获取发酵液，并将发酵液进行离心、硫酸铵沉淀、离子交换、C18反相高效液相色谱柱分离制备后得到纯度较高的活性组分，最后鉴定为多粘菌素A1。多粘菌素A1对多种革兰氏阴性致病菌具有很好的抑菌效果，可以在制备抑制革兰氏阴性致病菌药物中应用。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种多粘菌素A1生产菌株、多粘菌素A1的制备方法和应用。

背景技术

多粘菌素是由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的一组环脂肽类抗生素，对革兰氏阴性菌具有抑菌作用，对治疗多药耐药革兰氏阴性菌引起的感染(特别是鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷菌)具有良好效果，从而引起临床的广泛关注。目前发现的多粘菌素主要包括A、B、C、D、E等组分，且每个组分均有多个变体。临床上应用较多的是多粘菌素B和多黏菌素E的硫酸盐和甲磺酸盐，且分别均为多个变体混合物。

多粘菌素A(polymyxin A)是Brownlee与其英国威尔康生理学研究实验室的同事于1947年从萨里市场花园土壤中分离出的一种被确定为气孢杆菌的生物体中分离鉴定出的一种抗生素物质。起初它被命名为Aerosporin，随后发现它与多粘菌素具有非常相似的抗菌谱和生物活性且属于同一家族抗生素化合物。根据国际协定，所有来自多粘芽孢杆菌的抗生素都采用了“polymyxin”这个通用名称，并开发了一个术语描述了这个家族的不同的抗生素。因此，Aerosporin被称为多粘菌素A。多粘菌素A根据所含脂肪酸链的不同分为A1和A2两种变体，A1为6-methyloctanoyl(C₉H₁₇O)，A2为6-methylheptanoyl(C₈H₁₅O)。继Aerosporin之后，很少有关于其他多粘菌素A产生菌株及其分离鉴定的相关报导。

发明内容

针对多粘菌素多为多粘类芽孢杆菌产生，且多粘菌素A1鲜有被发现和报道，本发明提供了一种多粘菌素A1的生产菌株，经全基因组鉴定为一株解硫胺类芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus)，同时提供了一种多粘菌素A1的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种多粘菌素A1生产菌株，该菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)SY20，于2021年9月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC No:61909。然后，通过对上述菌株进行微生物发酵获取发酵液，并将发酵液进行离心、硫酸铵沉淀、离子交换、C18反相高效液相色谱柱分离制备后得到纯度较高的活性组分，鉴定为多粘菌素A1。

所述菌株在发酵生产多粘菌素A1中的应用。

优选地，将所述菌株发酵培养后，将发酵液进行离心，再经“三步法”硫酸铵沉淀-阳离子交换层析-反相层析，制得多粘菌素A1。

所述多粘菌素A1的制备，具体包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述菌株接种于LB培养基中，发酵培养后，离心收集发酵上清液；

(2)在所得到的发酵上清液中加入硫酸铵使得上清液的硫酸铵饱和度为50％～100％，静置后得到悬浊液；

(3)将所得的悬浊液离心，收集沉淀用水溶解后获得含硫酸铵的粗蛋白溶液；

(4)将得到的含硫酸铵粗蛋白溶液透析除盐后，真空冷冻干燥得到粗蛋白，再经分离纯化，得到多粘菌素A1。