[发明专利]一种多粘菌素A1生产菌株及其应用

权利要求书

1.一种多粘菌素A1生产菌株，其特征在于，该菌株为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）SY20，于2021年9月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC No: 61909。

2.权利要求1所述菌株在发酵生产多粘菌素A1中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，将权利要求1所述菌株发酵培养后，将发酵液进行离心，再经硫酸铵沉淀-阳离子交换层析-反相层析，制得多粘菌素A1。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述菌株接种于LB培养基中，发酵培养后，离心收集发酵上清液；

（2）在所得到的发酵上清液中加入硫酸铵使得上清液的硫酸铵饱和度为50%~100%，静置后得到悬浊液；

（3）将所得的悬浊液离心，收集沉淀用水溶解后获得含硫酸铵的粗蛋白溶液；

（4）将得到的含硫酸铵粗蛋白溶液透析除盐后，真空冷冻干燥得到粗蛋白，再经两次分离纯化，得到多粘菌素A1。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将步骤（4）中粗蛋白的分离纯化：将粗蛋白用缓冲液溶解，除菌后在阳离子交换色谱柱上进行洗脱分离，其中，洗脱条件为：平衡液A的比例为 0~40%，洗脱液B的比例为 60~100%，收集洗脱组分，即为部分纯化的活性组分；所述平衡液A组成为20 ~50 mM Tris-HCl，pH 7.0~9.0，洗脱液B组成为20~50 mM Tris-HCl+1MNaCl，pH 7.0~9.0。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述部分纯化的活性组分再进行如下分离纯化处理：

（a）进行透析除盐、真空冻干后用水溶解；

（b）将溶解的活性组分通过半制备液相系统，利用液相色谱柱进一步精纯，收集保留时间为9.248±1.0min的峰组分；

（c）将步骤（b）得到的组分进行透析除盐，再经真空冷冻干燥制得高纯度活性组分粉末；

所述色谱条件：色谱柱为C18-H，流动相为乙腈：硫酸钠溶液=（20~22）:（78~80），其中硫酸钠溶液浓度为25~35 mM，用磷酸调pH为2.3~2.5；色谱柱温度：30±5℃。

7.根据权利要求4或5或6所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述硫酸铵饱和度为65%~100%；步骤（1）所述的发酵培养条件：25~40℃、1~10%接种量、100~300 rpm发酵培养24~72h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述的发酵培养条件：28~37℃、1~5%接种量、120~200 rpm发酵培养32~48 h；所述离心的条件为：8000~10000 rpm离心15±5min；步骤（2）所述静置的条件是于4℃下静置过夜；步骤（3）所述离心的条件为将悬浊液于8000~10000 rpm、4℃条件下离心10~20min。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（4）和（a）、（c）中所述透析条件均为：透析袋的截留孔径为500 Da，用水在4℃条件下进行透析。