[发明专利]与冷冻精子质量或其所形成胚胎发育相关microRNA标志物及其应用

说明书

本发明公开了基因工程和生殖医学领域中与冷冻精子质量或其所形成胚胎发育相关的microRNA标志物及其应用。与冷冻精子质量或胚胎发育相关的microRNA标志物选自miR‑30b‑5p、miR‑148b‑3p和miR‑140‑5p中的一种或多种。与新鲜精子相比，人和小鼠精子冷冻组的miR‑148b‑3p和miR‑30b‑5p均显著下调，miR‑140‑5p显著增加，靶标microRNA进一步通过调控下游基因的表达，影响胚胎的发育潜能。通过检测冷冻精子中3个靶标microRNA的表达，可用于预测冷冻精子样本的质量及其在后续所形成胚胎的发育潜能，并可针对该靶点开发相应冷冻保护剂。

技术领域

本发明属于基因工程和生殖医学领域，具体涉及与冷冻精子质量或其所形成胚胎发育相关microRNA标志物及其应用。

背景技术

在近几十年，随着低温生物学领域的显著发展，冷冻保存技术使人类生育力保存和珍稀种质的延续得到进一步的发展，特别是对于人类辅助生殖技术(AssistedReproductive Technologies,ARTs)。生育力保存(Fertilization Preservation)是生殖医学的一个新兴领域，该技术主要是保护存在不孕风险人的生育力。在过去的20年里，越来越多的人关注生育力的保存。据世界卫生组织统计，不孕不育症已经成为继心脑血管病和肿瘤之后，威胁人类健康的第3大疾病。随着生活压力的增加、生育年龄推迟、环境污染、生活方式等变化，不孕不育症的发病趋势呈现逐年上升的趋势。冷冻技术是辅助生殖技术中的一个关键技术，并且该技术在临床上得到广泛的应用。例如，2018年在中国医学会统计数据结果表明冷冻胚胎保存技术应用于ARTs的高达63％。

现临床上，除不孕不育患者，生育力保存还应用于癌症或者自身免疫疾病患者。因为在癌症患者和免疫性疾病患者治疗过程中，其治疗技术会造成生殖腺毒性，严重可损害其生育力。随着测序技术发展和癌症发生发展的深入研究，如今癌症患者的预后生存率明显增加，中国癌症患者的5年生存率可达40.5％，日本癌症患者的5年生存率可达74.5％，这就表明很大一部分癌症或者自身免疫疾病的患者可以活到生育年龄。这也驱使科研人员和医务人员的关注点不仅仅是癌症患者的疾病治疗，同时也应考虑患者后期生活质量，特别是对于未婚男女患者和想要保护生育力的患者。

随着社会发展，现在人们也越来越关注非医疗目的的冷冻保存(‘non-medical’orelective cryopreservation)。在各种社会压力因素情况下，如职业发展、缺少伴侣等因素，导致女性和男性的生育年龄逐步增长。而且众所周知，随着年龄增加，男女性生育力降低。并且女性在 37岁时，其卵子数量下降到25000个左右，所妊娠的胎儿染色体突变和减数分裂畸变率也会增加。这也就迫使社会越来越关注非医疗性生育力保存此外。此外，包括中国在内，许多国家都在致力于卵子库的构建，但由于没有关于安全性、有效性和明确的指导方针，对其研究的还需更加深入。

综上表明，当今社会对生育力保存的需求越来越大，这也值得科研人员和临床人员对其有高度的重视。

现冷冻保存主要包括配子、胚胎以及卵巢或睾丸组织保存。同时该技术已成为人类辅助生殖技术中一个重要的环节。冷冻保存技术主要包括三种方法：快速冷冻技术、玻璃化冷冻技术、慢速冷冻技术。其中精子冷冻采用快速冷冻技术，卵子和胚胎的冷冻采用玻璃化冷冻技术。卵巢组织和睾丸组织采用慢速冷冻技术。尽管冷冻技术不断改进，但是细胞在冷冻保存过程仍会受到冷冻损伤、胞内冰晶形成和细胞发生变化等一系列因素的影响。早期对冷冻技术的研究主要在细胞的形态结构、复苏率、囊胚形成率、发育潜能等方面研究，研究人员较少关注是在转录组和表观遗传方面的影响。近几年，越来越多的研究证实，冷冻会造成细胞中遗传物质的改变，此外早期胚胎阶段是一个动态变化过程，其转录组和甲基化等遗传基因是动态变化的过程，而冷冻过程中任何一个外界因素都会导致胚胎形态，分子水平和基因等改变。