[发明专利]一种检测膀胱癌细胞用检测试剂盒及其制备方法、膀胱癌细胞的检测方法

说明书

本发明提出了一种检测膀胱癌细胞用检测试剂盒及其制备方法、膀胱癌细胞的检测方法，属于生物分析技术领域，包括DNA，crRNA，Cas13a，T7 RNA聚合酶，NTPs，抗体以及PBS缓冲体系。本方法采用T7体外转录，CRISPR/Cas13a以及HCR三重信号扩增技术，显著提高了检测灵敏度；两种蛋白同时存在下才能使信号输出的这种“and”逻辑门的应用提高了分析的准确性。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，具体涉及一种检测膀胱癌细胞用检测试剂盒及其制备方法、膀胱癌细胞的检测方法。

背景技术

膀胱癌是世界范围内第十大常见的泌尿系统恶性肿瘤，其复发率高，临床预后差。膀胱癌的肿瘤突变率在所有肿瘤中排名第三，在男性中更常见，是男性第六大常见癌症，且男性的发病率和死亡率约为女性的4倍。目前，膀胱癌诊断的金标准是膀胱镜检查和尿细胞学。然而，膀胱镜检查成本高，具有侵入性，且灵敏度并非最佳。尿细胞学检查虽然是一种非侵入性检查但其敏感度较低且与膀胱癌的病理分期分级有关。对于膀胱癌的治疗而言，最常见的手段有膀胱切除术和放化疗等。近年来，聚焦于免疫检查点的免疫疗法在癌症治疗中的地位日趋重要，为患者带来了新的希望。

免疫检查点是一类共抑制信号，它可以调节免疫激活程度，防止免疫系统对正常细胞免疫过度。肿瘤细胞在长期进化过程中也在其细胞表面高表达免疫检查点蛋白，借此来逃避免疫系统的免疫监视。通过对免疫检查点的分析可以支持临床医生进行靶向治疗选择。因此，免疫检查点也可被认为是肿瘤蛋白生物标志物，通过它来实现疾病的诊断和预后监测具有较高的敏感性和特异性。CD47，又称整合素相关蛋白，是组织稳态的关键调节器，参与调节细胞凋亡、增殖和免疫过程，可通过逃避吞噬作用来保护宿主细胞。肿瘤细胞表面上调的CD47与巨噬细胞表面的SIRP-α结合，可以向巨噬细胞传递“别吃我”的信号，进而逃避免疫系统的攻击。这种机制使其成为了肿瘤免疫治疗领域具有前景的新免疫检查点。上皮细胞黏附因子EpCAM参与细胞的粘附，增殖以及迁移，其在正常情况下广泛表达于正常上皮细胞中，在病理情况下可能通过参与Wnt-β-连环蛋白肿瘤信号传导通路从而在多种上皮源性恶性肿瘤中异常表达。EpCAM的表达水平也与疾病预后相关，同样是一种肿瘤诊断标志物。

在蛋白肿瘤标志物丰度低的情况下，要想通过对其识别来进行细胞检测，将DNA-抗体交联物与蛋白抗原识别从而通过核酸扩增技术来实现信号放大是一个不错的选择。聚合酶链式反应(PCR)虽是DNA扩增的金标准但由于其需要昂贵的精确控制反应温度的仪器从而限制了其应用。近年来，许多等温扩增技术(有酶或无酶参与)如催化发夹组装(CHA)，杂交链式反应(HCR)，环介导的等温扩增(LAMP)，链置换扩增(SDA)，滚环扩增(RCA)等已被开发为成熟的可替代PCR的方法，广泛应用于生物传感领域。除此之外，转录扩增也作为一种高催化性能的RNA扩增技术吸引了研究人员的关注。T7 RNA转录扩增是一种DNA依赖的RNA等温扩增技术。它在特定T7启动子序列存在的情况下沿着5’-3’方向起始DNA双链或单链模板下游片段的RNA合成，也就是说，该方法可有效消除非特异性扩增并可在短时间内以高杂交效率和快速酶动力学转录出大量游离的单链RNA。

簇状的规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR)/Cas13a是继Cas12a、Cas12b后发现的CRISPR/Cas家族的新成员。与Cas12a等不同的是，它是RNA激活型蛋白。也就是说，Cas13a/crRNA在识别其目标RNA后，可以切割附近的非特异性单链RNA使其裂解，即反式切割功能。这样的反式切割活性以其强大的信号放大功能，在生物分析领域显示出广阔的应用前景，而将之与其它放大方法相结合便可实现信号的级联放大。比如经T7转录介导的扩增(TMA)后产生的RNA可直接激活Cas13a以实现信号的双重放大，Hou等人提出了一种靶标诱导的转录扩增触发Cas13a用于检测碱性磷酸酶的方法，或是Cas13a在RNA碱基位点反式切割后与上述核酸扩增技术联合实现信号放大，Zhou等人曾开发了一种Cas13a-HCR用于SARS-CoV-2的检测平台。