[发明专利]一种检测膀胱癌细胞用检测试剂盒及其制备方法、膀胱癌细胞的检测方法

权利要求书

1.一种检测膀胱癌细胞用检测试剂盒，其特征在于，包括DNA，2μL crRNA，4μL Cas13a，20μL T7 RNA聚合酶，4μL NTPs，20μL抗体以及PBS缓冲体系。

2.根据权利要求1所述检测膀胱癌细胞用检测试剂盒，其特征在于，所述DNA包括2μLactivate probe、20μL trigger probe、20μL H1和20μL H2。

3.根据权利要求2所述检测膀胱癌细胞用检测试剂盒，其特征在于，所述activateprobe的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

4.根据权利要求2所述检测膀胱癌细胞用检测试剂盒，其特征在于，所述triggerprobe的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

5.根据权利要求2所述检测膀胱癌细胞用检测试剂盒，其特征在于，所述H1的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

6.根据权利要求2所述检测膀胱癌细胞用检测试剂盒，其特征在于，所述H2的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

7.根据权利要求1所述检测膀胱癌细胞用检测试剂盒，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

8.一种如权利要求1-7任一项所述检测膀胱癌细胞用检测试剂盒的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

S1.抗体连接DNA：

抗体活化：称取琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐溶于水中，得到SMCC溶液，称取三(2-氯乙基)磷酸酯溶于PBS中，得到TCEP溶液，取anti-CD47加入到SMCC溶液中，25-35℃反应1-3h，取anti-EpCAM加入到SMCC中25-35℃反应2h；

DNA还原：取activate probe与TCEP溶液混合，25-35℃反应1-3h，同时取退火后的trigger probe与TCEP溶液混合25-35℃反应1-3h，反应结束后，用超滤管超滤活化后的抗体溶液，将离心后的该溶液与还原后的DNA溶液混合30℃继续反应1-3h，反应结束后得到抗体连接DNA，备用；

S2.将步骤S1得到的anti-CD47-activate probe与anti-EpCAM-trigger probe同时加入细胞中与35-40℃下反应0.5-2h，反应后洗去未结合的探针；

S3.往反应体系中加入T7 RNA聚合酶，buffer，NTPs，100μM的T7序列，PBS，于25-35℃反应1-3h后，加入Cas13a，CrRNA，继续反应20-40min，反应结束后离心弃上清；

S4.加入退火后的H1和H2，再加入160μL PBS溶液，于35-40℃反应0.5-1.5h。

9.一种膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于，采用根据权利要求1所述的检测膀胱癌细胞用检测试剂盒进行检测，具体步骤为：将得到的抗体连接DNA，分别与不同数量的细胞温育，离心后加入T7 RNA聚合酶，buffer，NTPs，T7序列，PBS，于35-40℃反应1-3h后，加入Cas13a，CrRNA,，反应20-40min，反应结束后离心弃上清，加入退火后的H1和H2，再加入PBS溶液，于35-40℃反应0.5-1.5h，利用荧光光谱分析装置，检测参照试剂的光谱，并做出靶细胞荧光强度的线性图，根据线性图检测膀胱癌细胞。

10.根据权利要求9所述的膀胱癌细胞的检测方法，其特征在于，所述方法的线性方程为：F＝736.757LogC-1434.627(R²＝0.9897)，线性检测范围为：5×10²～1×10⁵cell/mL，检测限为：30cell/mL。