[发明专利]制备重组腺相关病毒的辅助质粒及其应用

说明书

本公开提供了一种用于制备重组腺相关病毒的辅助质粒，其包括：1)AAV的Rep和Cap蛋白编码序列；2)至少一个启动子序列；以及3)至少一个DA’序列或DA’序列的反向互补序列AD’序列。本公开还提供了该辅助质粒在提高重组腺相关病毒生产能力方面的应用。在加入AD’或DA’序列的情况下，本公开提供的辅助质粒可显著提升细胞的AAV产量。

技术领域

本发明涉及基因工程和在人源细胞中的AAV生产，具体涉及一类新型的AAV包装辅助质粒，及其在AAV生产中的应用。

背景技术

目前，基因治疗从四十年前的科学家的梦想正逐步变成了现实。多种病毒、非病毒载体经过多年的演变、淘汰，目前重组腺相关病毒(rAAV)载体是公认为符合安全性、有效性、特异性三个标准的基因治疗载体。但是，由于业界大规模生产AAV的能力有限，因而临床应用的普及程度也受此制约。

因此，AAV的产量瓶颈亟待打破。在生产上游改进、创新，提高AAV产率是目前降低目前基因治疗生产成本的关键点之一。目前，三质粒转染法简单、快速，是被广泛采用的AAV生产方法。该方法涉及使用三个质粒共转染HEK293细胞：一个辅助质粒pADhelper，提供四个腺病毒元件；一个辅助质粒pRC，提供AAV的Rep和Cap蛋白编码序列，其中Rep蛋白负责AAV基因组的复制与协助AAV基因组颗粒的组装，Cap蛋白组成AAV外壳；一个包括目的序列的质粒，可简称为pGOI，目的序列的上下游各有一个天然AAV基因组中的5’ITR和3’ITR序列。

通常情况下，一个AAV血清型X的pRC质粒中编码序列由来自AAV2的Rep2和编码AAVX的外壳蛋白CapX组成，P5启动子是启动Rep、Cap表达的关键启动子，通常P5启动子置于RepCap编码前，如图2中“P5+RC”所示。X.Xiao等人曾报道在RC的上下游各放置一个P5启动子，可以提高AAV的产率[1]。在目的质粒pGOI中，置于目的基因(或者目的序列)的上下游的ITR，其单个序列全长145bp，被认为与AAV基因组的复制与引导包装相关。因为ITR中存在反向自互补序列，因此在单链DNA的状况下会自互补形成T形的双链结构。T.R.Flotte等人曾发现完整的ITR具有启动子活性，驱动CFTR基因的表达[2]。但是，就驱动基因表达而言，ITR与传统启动子相比，仅具有非常低的转录活性[3]。

发明内容

一方面，本文提供了一种用于制备重组腺相关病毒的辅助质粒，其包括：1)AAV的Rep和Cap蛋白编码序列；2)至少一个启动子序列；以及3)至少一个DA’序列或DA’序列的反向互补序列AD’序列。

在一些实施方案中，所述至少一个DA’或AD’序列位于Rep和Cap蛋白编码序列的上游。

在一些实施方案中，所述至少一个DA’或AD’序列位于所述Rep和Cap蛋白编码序列的下游。

在一些实施方案中，所述辅助质粒从5’至3’方向依次包括：

i)DA’或AD’序列、启动子序列以及Rep和Cap蛋白编码序列；

ii)DA’或AD’序列、启动子序列、Rep和Cap蛋白编码序列以及DA’或AD’序列；

iii)DA’或AD’序列、启动子序列、Rep和Cap蛋白编码序列、DA’或AD’以及启动子序列；或

iv)Rep和Cap蛋白编码序列、DA’或AD’序列以及启动子序列。

在一些实施方案中，所述启动子为P5启动子。

在一些实施方案中，所述P5启动子序列包括SEQ ID NO：2所示序列或与SEQ IDNO：2所示序列具有至少90％序列一致性的功能性变体。

在一些实施方案中，所述DA’序列包括SEQ ID NO：4所示序列或为与SEQ ID NO：4所示序列具有至少90％序列一致性的功能性变体。