[发明专利]产二氢尼洛替星的重组酿酒酵母及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种重组酿酒酵母及其制备方法与应用。本发明提供的重组酿酒酵母，其保藏编号为CGMCC No.23630。与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：本发明提供的重组酿酒酵母能产二氢尼洛替星，为实现二氢尼洛替星的生物合成提供了工程菌，为酿酒酵母工业化生产二氢尼洛替星化合物提供新的途径，还可以将其作为底盘菌株在胞内鉴定印楝生物下游合成途径中的功能基因。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用合成生物学生产三萜化合物等技术领域，具体地，本发明涉及产二氢尼洛替星的重组酿酒酵母的制备方法及其应用。

背景技术

印楝素是一种公认无害的植物源杀虫剂，是从楝属植物印楝种子中提取的一种高度氧化的柠檬苦素类三萜化合物，有10多种类似物，但大家通常所说的印楝素指的是印楝素A，相对分子质量为720.71。印楝素纯品为白色非结晶物质，易溶于甲醇、丙酮和二甲亚砜等极性有机溶剂，对光、热都不稳定。印楝素对200多种害虫有明显的驱避效果，使用更加安全、对环境的压力小，是目前全球公认的最优秀的生物农药。

印楝素及其前体物质二氢尼洛替星均具有杀虫功效，但是两者在植物中的含量很低，仅存在于印楝树的树叶树皮及种子中，其中种仁中印楝素的含量最高，但也仅有0.02%。印楝素的含量还取决于印楝的品种以及种子的收获时间，随着种子的成熟，印楝素的含量会呈现先增加再下降的趋势。另外，印楝素的含量与种植的气候条件有关，雨水温度湿度均会影响印楝素的含量，印楝生长8年到盛果期株产带内果皮的种子有30kg-50kg。由于印楝是唯一的印楝素生物制品加工的原材料，且喜热，只适宜在热带亚热带的干旱地区生长，通过自然界提取大量印楝素大规模商用较为困难，因此通过化学合成和生物合成的手段来获取印楝素及其前体二氢尼洛替星成为研究热点。

科学家们最初在1987年开始研究印楝素的化学合成，因其复杂的结构，花费22年实现了印楝素的全合成，但该合成步骤多达71步，收率仅有0.00015%。化学合成成本高，收率低，限制了其工业化生产。因此科学家们将目光转向了生物合成，通过微生物发酵药用植物活性成分具有成本低，环境友好且不受时空限制等优势，因此学者们很关注通过微生物来生产药用植物次生代谢产物。Yan等成功从人参中克隆出一个催化原人参二醇生成人参皂苷CK的糖基转移酶基因UGTPg1，然后通过将人参皂苷CK合成途径的基因引入酿酒酵母，获得了可以生产人参皂苷CK的酿酒酵母菌株。但印楝素等柠檬苦素类化合物的生物合成途径几乎是空白的，想在微生物中组装其合成途径是一个非常巨大的挑战。

发明内容

基于以上技术问题，本发明的目的之一是提供一株重组酿酒酵母，该酿酒酵母能产二氢尼洛替星，为实现二氢尼洛替星的生物合成提供了工程菌。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一株重组酿酒酵母，其保藏编号为CGMCC No.23630。

一种重组酿酒酵母的制备方法，所述制备方法包括：敲除酿酒酵母中的BTS1基因和ERG27基因，过表达所述酿酒酵母的ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因和IDI1基因，并在所述酵母菌中外源表达AtCPR基因、AiOSC1基因、tHMGR基因、AtSQE2基因和AiCYP71CD2基因。

在其中一些实施例中，所述制备方法包括：

敲除酿酒酵母中的BTS1基因和ERG27基因，制备酿酒酵母C-E-B；

在所述酿酒酵母C-E-B的染色体rDNA位点整合ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因、IDI1基因和AtCPR基因，制备酿酒酵母CB-9；

在所述酿酒酵母CB-9的染色体Delta位点上整合AiCYP71CD2基因、AiOSC1基因、tHMGR基因和AtSQE2基因，制备酿酒酵母DI-3，获得重组酿酒酵母；

所述AiCYP71CD2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。