[发明专利]产二氢尼洛替星的重组酿酒酵母及其制备方法和应用有效
| 申请号： | 202111576150.3 | 申请日： | 2021-12-22 |
| 公开（公告）号： | CN113956990B | 公开（公告）日： | 2022-06-03 |
| 发明（设计）人： | 薛强;王彩霞;侯康鑫;苏新尭;刘佳;于宛彤 | 申请（专利权）人： | 中国中医科学院中药研究所 |
| 主分类号： | C12N1/19 | 分类号： | C12N1/19;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12P17/18;C12R1/865 |
| 代理公司： | 北京华进京联知识产权代理有限公司 11606 | 代理人： | 彭辉 |
| 地址： | 100010 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 产二氢尼洛替星 重组 酿酒 酵母 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种二氢尼洛替星的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以重组酿酒酵母为工程菌进行发酵的步骤；
所述重组酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No. 23630；
发酵采用的条件包括：28℃～32℃，pH5.0～5.5，转速100～800rpm，溶氧＞30%，发酵时溶氧与转速关联，自动补糖与溶氧负反馈关联；种子液接种至装有含葡萄糖的YPD培养基的发酵罐中，当葡萄糖含量为0时开始用半乳糖补料，每隔12h取样，发酵144h。
2.根据权利要求1所述的二氢尼洛替星的制备方法，其特征在于，所述重组酿酒酵母的制备方法包括：敲除酿酒酵母中的BTS1基因和ERG27基因，过表达所述酿酒酵母的ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因和IDI1基因，并在所述酵母菌中外源表达AtCPR基因、AiOSC1基因、tHMGR基因、AtSQE2基因和AiCYP71CD2基因。
3.根据权利要求2所述的二氢尼洛替星的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
敲除酿酒酵母中的BTS1基因和ERG27基因，制备酿酒酵母C-E-B；
在所述酿酒酵母C-E-B的染色体rDNA位点整合ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因、IDI1基因和AtCPR基因，制备酿酒酵母CB-9；
在所述酿酒酵母CB-9的染色体Delta位点上整合AiCYP71CD2基因、AiOSC1基因、tHMGR基因和AtSQE2基因，制备酿酒酵母DI-3，获得重组酿酒酵母；
所述AiCYP71CD2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求3所述的二氢尼洛替星的制备方法，其特征在于，获取所述AiCYP71CD2基因的步骤包括：以印楝的cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示的扩增引物进行扩增，获得所述AiCYP71CD2基因。
5.根据权利要求3或者4所述的二氢尼洛替星的制备方法，其特征在于，在染色体rDNA位点上整合的同源重组片段依次包含IDI1基因、ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因和AtCPR基因。
6.根据权利要求3或者4所述的二氢尼洛替星的制备方法，其特征在于，所述AiCYP71CD2基因在所述Delta位点上连接于所述AiOSC1基因和所述tHMGR基因之间。
7.根据权利要求3或者4所述的二氢尼洛替星的制备方法，其特征在于，整合采用醋酸锂转化法。
8.根据权利要求2至4任一项所述的二氢尼洛替星的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括从所述重组酿酒酵母中挑选出二氢尼洛替星产量高的重组酿酒酵母的步骤。
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