[发明专利]一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法、荧光强度参考载体的制作方法及用途

权利要求书

1.一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1)在载体表面共价结合凝集素；

2)对体液糖蛋白提取并用荧光标记糖蛋白；

3)将荧光标记的糖蛋白与固定有凝集素的载体结合，在其表面形成凝集素与岩藻糖的亲和结合。

2.根据权利要求1所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述在载体表面共价结合凝集素包括：

将载体浸入含有氧化剂的缓冲溶液中，在室温下反应，使得所述载体上的葡萄糖中的邻位二羟基被氧化形成两个醛基；

将所述载体取出，浸泡在NaCl溶液中振荡清洗，取出后再浸泡在去离子水中振荡清洗，最后将所述载体取出；

将所述载体在含有凝集素的PBS溶液中反应；

在所述含有凝集素的PBS溶液中加入氰基硼氢化钠，轻微振荡，室温反应得到凝集素载体；

将所述凝集素载体依次浸入NaCl溶液、ACN溶液和去离子水中清洗，获得表面具有岩藻糖凝集素的载体。

3.根据权利要求2所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于：所述载体为试纸或球状树脂，当选择所述试纸作为载体时，所述试纸具有纤维素，当选择所述球状树脂作为载体时，所述球状树脂具有醛基。

4.根据权利要求2所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于：所述氧化剂为高碘酸钠，所述氧化剂在所述缓冲溶液中的浓度为5-20mM，所述缓冲溶液为90-100mM的醋酸钠。

5.根据权利要求2所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于：所述凝集素为LCA、UEAI或AAL中的任意一种或多种。

6.根据权利要求2所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述对体液糖蛋白提取并用荧光标记糖蛋白包括步骤：

采集体液，并放置于离心管内；

在所述体液中加入乙醇，通过沉淀法提取所述体液中的蛋白质；

将所述蛋白质重新溶解于二异丙基乙胺中，并混合均匀，获得样本；

在所述样本中加入与所述蛋白质重量比相等的荧光标记试剂，并在室温下反应，获得具有荧光标记的糖蛋白溶液。

7.根据权利要求6所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述将荧光标记的糖蛋白与固定有凝集素的载体结合，在其表面形成凝集素与岩藻糖的亲和结合包括步骤：

(1)用所述具有荧光标记的糖蛋白溶液将所述表面具有岩藻糖凝集素的载体浸湿，在室温下培育，使得凝集素与岩藻糖充分结合；

(2)当所述表面具有岩藻糖凝集素的载体上具有一种凝集素时，用凝集素缓冲液清洗；当所述表面具有岩藻糖凝集素的载体上具有多种凝集素时，用至少一种洗脱液洗脱凝集素结合糖蛋白，使得所述表面具有岩藻糖凝集素的载体上保留至少一种凝集素结合糖蛋白；

(3)将所述表面具有岩藻糖凝集素的载体依次浸入NaCl水溶液、ACN溶液和去离子水中，轻微振荡，将非亲水结合的非岩藻糖糖蛋白洗脱；

(4)将所述表面具有岩藻糖凝集素的载体放置于荧光检测系统，定量分析。

8.根据权利要求7所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述凝集素缓冲液包括：LCA缓冲溶液、UEAI缓冲溶液、AAL缓冲溶液中的任意一种或多种，所述LCA缓冲溶液为10mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1mM CaCl₂，所述UEAI缓冲溶液为10mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1mM CaCl₂，所述AAL缓冲溶液为10mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1mM CaCl₂；所述洗脱液包括：LCA洗脱溶液、UEAI洗脱溶液和AAL洗脱溶液，所述LCA洗脱溶液为200mMα-甲基葡萄糖苷和200mMα-甲基甘露糖苷的混合物；所述UEAI洗脱溶液为50mM-100mM L-岩藻糖；所述AAL洗脱溶液为50mM-100mM L-岩藻糖。