[发明专利]一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法

说明书

本发明公开了一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法，包括步骤：苹果无融合生殖砧木全基因组测序；测序木本材料单株去掉柱头后采收种子；采收的种子低温冷藏层积；不同浓度EMS诱变，种子萌发并播种；收集种子进行层积萌发；水培并鉴定表型；差异材料植物组织培养，诱导生根鉴定根系表型；差异材料进行全基因组重测序和转录组测序；寻找诱变基因；发根农杆菌转化体系进行诱变基因功能验证。本发明利用苹果无融合生殖特性、根系表型分析及转录组高通量快速筛选鉴定新型无融合砧木，极大的节省了筛选的时间与空间，且方法流程简单、操作技术容易掌握，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法。

背景技术

无融合生殖是指不经过精子与卵细胞的受精结合而直接产生无性胚和无性种子的一种特殊的无性繁殖，其子代在遗传上是其母本的克隆，保留着母本的基因型，其后代不产生分离现象，从而表现出高度的整齐一致性及其他的优良性状，并在繁殖过程中能够保留下来。与现行苹果栽培应用的有性种子作基砧和无性系矮砧相比，无融合生殖砧木具有许多优点：通过无性种子繁殖，后代整齐一致；繁殖系数高，与扦插、压条等繁殖方式相比，繁殖效率高，根系壮，立地性好，适应性强；不带病毒，适应现代果树无毒栽培的发展趋势。

无融合生殖实生砧木首先要具备无融合生殖特征，并且一别以往的无性繁殖方法，而采用种子播种进行实生繁殖。大多数果树的遗传物质都是高度杂合的，实生繁殖将产生大幅度的分离，而使后代参差不齐。为防止这种现象的发生，实生砧木必须具有无融合生殖特征。

但目前对于具有无融合生殖特性的实生砧木存在创制困难的问题，制约了无融合生殖在育种程序和无性种子生产中的应用。尤其是苹果砧木选育上，存在童期长、植株占空间大、筛选周期长，高度的无融合生殖性状不能通过有性杂交传递给后代的问题。

发明内容

本发明提供了一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法。本发明克服了苹果无融合生殖砧木的增殖特征，实现其快速高目的性增殖，节省了极大的时间与空间，可以大规模快速获得新型异源多倍体砧木并进行诱变基因功能鉴定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法，包括以下步骤：

（1）对苹果无融合生殖砧木进行全基因组测序；

（2）在苹果无融合生殖砧木开花时期，去除柱头采收种子；

（3）采收的种子低温冷藏层积后，进行诱变处理、消毒，然后再次低温冷藏层积，进行播种，待得到的萌发幼苗长出根系移栽水培；

（4）鉴定水培幼苗的根系表型；

（5）选取根系表型有差异的幼苗扦插生根，再次鉴定根系表型；

（6）选取扦插生根的根系表型有差异的幼苗进行组织培养，诱导生根后鉴定根系表型，得到差异诱变砧木；

（7）将差异诱变砧木进行全基因组测序和转录组测序，与步骤（1）全基因组测序结果进行比较获得诱变基因；

（8）对诱变基因进行功能验证。