[发明专利]一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法

权利要求书

1.一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对苹果无融合生殖砧木进行全基因组测序；

（2）在苹果无融合生殖砧木开花时期，去除柱头采收种子；

（3）采收的种子低温冷藏层积后，进行诱变处理、消毒，然后再次低温冷藏层积，进行播种，待得到的萌发幼苗长出根系移栽水培；所述低温冷藏层积的步骤为：将采收的种子与潮湿沙土混匀置于4℃冰箱中层积25-50天；

（4）鉴定水培幼苗的根系表型；

（5）选取根系表型有差异的幼苗扦插生根，再次鉴定根系表型；所述根系表型的差异为侧根数量增多；

（6）选取扦插生根的根系表型有差异的幼苗进行组织培养，诱导生根后鉴定根系表型，得到差异诱变砧木；

（7）将差异诱变砧木进行全基因组测序和转录组测序，与步骤（1）全基因组测序结果进行比较获得诱变基因；

（8）对诱变基因进行功能验证。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中采用PacBio Hifi测序、Oxford Nanopore Technology 测序和Illumina 二代测序平台对苹果无融合生殖砧木进行全基因组测序；然后利用Canu hifi 软件对得到的原始测序数据进行组装，组装结果用NextPolish 软件和二代Illumina 数据进行校正并组装高质量基因组，利用已知苹果基因组序列和Hi-C数据，采用ALLHiC软件进行Contig的分相和挂载，得到挂载到全部染色体的苹果无融合生殖砧木基因组序列，对挂载到染色体的基因组利用NECAT校正的ONT测序数据进行Gap Closing, 然后利用PacBio hifi 数据进行Gap Closing，得到最终的染色体水平的分相的苹果无融合生殖砧木基因组。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱变处理为化学诱变，所述化学诱变的试剂为EMS或秋水仙素或5 -溴尿嘧啶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（7）中采用Solexa平台和SOLiD平台对差异诱变砧木进行全基因组测序和转录组测序，通过比较基因组学和转录组WGCNA分析，获得诱变基因的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（8）中利用诱变基因来构建目的基因超表达载体，转入发根农杆菌后，侵染野生型组培苗茎尖1.0 cm，经共培养和筛选培养后获得转基因根系，进行功能验证。

6.利用权利要求1-5任一项所述的方法获得的诱变基因，其特征在于，所述诱变基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

7.根据权利要求6所述的诱变基因，其特征在于，所述诱变基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

8.权利要求6所述的诱变基因在用于鉴定无融合诱变系苹果砧木中的应用。