[发明专利]一种双平台联用的外周血cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法

说明书

本发明提出了一种双平台联用的外周血cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法，通过使用适配Illumina因美纳二代测序平台和纳米孔测序平台的通用Y型接头设计，解决了样品起始量不足的现实条件下，如何获得有效的核酸突变信息和修饰信息的问题。连接Y型接头的核酸短片段文库直接使用二代平台测序，可获得片段化核酸的高准确率的突变信息；连接Y型接头的核酸短片段文库还可酶切处理后，通过露出的粘性末端连接，将碎片化的核酸连接成长片段(1kb)通过纳米孔，大大提高纳米孔的利用率、有效读长和总体数据量，同时获取了片段化核酸的修饰信息。数据产出后利用接头上的标签设计可以将多样本数据进行拆分，可以实现检测通量成数量级增加，降低单样品的检测成本。

技术领域

本发明涉及DNA甲基化检测技术领域，特别涉及一种双平台联用的外周血 cfDNA碱基突变和甲基化检测的方法。

背景技术

循环肿瘤DNA(ctDNA)是实体肿瘤细胞凋亡或破裂而释放进入外周血液循环系统的游离基因片段，大小在0.18-21kb，主要存在于血液、滑膜液和脑脊液等液体中。因此ctDNA携带着与其来源肿瘤DNA同样的基因缺陷，如点突变、重排、扩增、微卫星改变、表观遗传修饰等，可用作肿瘤DNA的替代来源。最近的研究表明，ctDNA通过启用非侵入性的“液体活检”(即可以对实体恶性肿瘤进行分子检测的血液检测)，具有癌症患者诊断，预后和监测标志的作用。

基因突变(Gene Mutation)是指基因组DNA分子发生一系列可遗传的变异现象，因其普遍存在于各类癌症当中而备受关注，基突变导致的相应蛋白异常表达是细胞信号通路调控异常而发生恶性转化的重要原因。随着液体活检技术的兴起，利用ctDNA检测基因突变并指导肿瘤的精准治疗已成为当下肿瘤研究领域的热点。

DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团(5mC)。它属于DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是公认地有希望早期检测癌症的生物标志物。高通量测序技术也被称作二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)，同时由于高通量测序能对一个物种的基因组和转录组进行全面、细致的分析，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。我国市场占有率最高的是Illumina因美纳公司的测序仪，除此外还有少部分life 公司的Ion Torrent测序仪和华大基因的BGI测序仪。

纳米孔检测技术作为一个新型检测平台，与二代测序技术相比，具有长读长、直接读取修饰信息和实时数据生产并行分析的特点，在长片段核酸检测变异(包括但不限于插入缺失、倒位易位、基因融合、RNA异常剪切、RNA编辑等多种核酸相关变异)和修饰信息(包括但不限于甲基化、乙酰化等)检测方面比二代测序或其他测序技术有更明显优势。使用纳米孔测序技术产出甲基化位点数据，可提高5mC识别的准确率，实现5mC的精准检测，提供包含高精度位点和精确的位点甲基化丰度的全基因组甲基化图谱。

应用依赖ctDNA的“液体活检”对癌症患者诊断、预后和监测具有显而易见的优势。但是，循环肿瘤DNA(ctDNA)在外周血中含量极低。通常10mL 的采血量提取到的cell-freeDNA，不足以分别建库完成多平台联合检测，或者是低投入量导致检测结果准确度降低。

二代测序平台的应用已趋于普遍，配套建库试剂盒丰富，测序费用低廉。碱基分辨率高，可达到99.99％。应用二代测序平台检测DNA突变优势明显，但是在甲基化修饰的检测上有较明显的劣势。目前依赖二代测序平台的DNA甲基化检测方法主要有两种：重亚硫酸盐转化测序法和免疫沉淀测序法。重亚硫酸盐转化测序法将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶后通过二代测序进行检测，但缺点是转化效率受限以及短读取测序对于基因组重复区域不能准确鉴定；免疫沉淀测序法能够检测DNA或RNA甲基化修饰，但达不到单碱基分辨率。