[发明专利]甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集检测方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集检测方法。该方法是将呼吸道样本与分别偶联有甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体的免疫磁珠混合，一定温度下混合孵育，使用磁性工具分离免疫磁珠‑病毒复合物，将复合物重悬于盐离子缓冲液中，将重悬的免疫磁珠‑病毒复合物进行加热裂解，使用磁性工具分离磁珠，对裂解产物（液体部分）使用荧光PCR检测试剂直接进行检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种甲型流感、乙型流感和呼吸道合 胞病毒的多重富集检测方法。

背景技术

目前临床检验中应用的针对流感病毒和呼吸道合胞病毒的方法主要有：单独 检测一个病毒核酸检测方法，如甲型流感病毒核酸检测试剂(荧光PCR法)， 呼吸道合胞病毒核酸检测试剂(荧光PCR法)；多种病毒核酸联合检测方法， 如甲型乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂(荧光PCR法)等。但 目前所应用的荧光PCR检测方法，作为一种酶促反应，仍然存在样本处理繁琐、 对核酸纯度要求高、PCR检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点，另外在血筛 等临床检验中现有的检测方法也无法满足其灵敏度的要求；以上的不足导致目前 针对流感病毒和呼吸道合胞病毒的荧光PCR检测方法在临床检验中的应用受到 了限制，尤其无法满足门诊和急诊的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集 检测方法，以解决现有检测技术中存在的样本处理繁琐、对核酸纯度要求高、PCR 检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集检测方法，具体包括 如下步骤：

S1、免疫磁珠的制备：将甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒三种抗体分别偶联至羧基修饰的超顺纳米磁珠上，得到三种偶联病毒抗体的免疫磁珠，

S2、病毒的富集：将甲型流感病毒阳性或乙型流感病毒阳性或呼吸道合胞病毒阳性的样本保存液，与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠混合孵育；

S3、用磁性工具分离免疫磁珠-病毒复合物，将免疫磁珠-病毒复合物重悬于TE 缓冲液中加热裂解；

S4、用磁性工具分离磁珠，得到富集浓缩的病毒，用多重荧光PCR试剂对裂解 产物中的液体直接进行检测，所述荧光PCR试剂包含以下引物探针(表1)：

表1

本发明检测方法主要过程是：将呼吸道样本与分别偶联有甲型流感病毒抗 体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体的免疫磁珠混合，一定温度下混合 孵育，使用磁性工具分离免疫磁珠-病毒复合物，将复合物重悬于盐离子缓冲液 中，将重悬的免疫磁珠-病毒复合物进行加热裂解，使用磁性工具分离磁珠，对 裂解产物(液体部分)使用荧光PCR检测试剂直接进行检测。使用多重荧光PCR 技术，在同一检测孔中加入13个引物探针，包含3个荧光通道，可检测甲型流 感病毒多个亚型(新型甲型H1N1流感病毒(2009)、季节性H1N1流感病毒、 H3N2、H5N2、H7N9)乙型流感病毒(Yamagata型及Victoria型)、呼吸道合 胞病毒(A型及B型)。在检测的同时可区分甲型流感、乙型流感和呼吸道合 胞病毒，有利于精准判断病情，辅助疾病早期的诊断和治疗。

本发明所述的荧光PCR检测试剂中含有耐抑制抗干扰的PCR反应缓冲液和 快速扩增的DNA聚合酶，能对含有各种干扰物质的样本进行有效扩增和荧光检 测。

作为优选，所述甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒等三种混合抗体均为 单克隆病毒表面抗体。