[发明专利]一种制备双链RNA的方法

说明书

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备双链RNA的方法，主要解决现有双链RNA制备方法步骤繁琐、效率低、成本高昂且难以实现大量制备的问题。针对要制备的双链RNA，先设计一个含有长度为5‑15bp泡状结构的、无启动子的环状双链DNA模板；然后在体系中同时加入上述无启动子环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、RNA酶抑制剂、NTPs和无机焦磷酸酶进行转录，转录过程中RNA聚合酶进行无偏好性的高效双向滚环转录，核糖核酸酶H则在环状双链DNA模板中泡状结构处单链DNA的辅助下实现对含有重复序列的转录产物的酶切，获得满足要求的双链RNA单体。本发明实现了双链RNA的一步、高效、大量制备。

技术领域

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备双链RNA的方法。

背景技术

双链RNA（dsRNA）结构在自然界中普遍存在，其常作为长链RNA，如核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）以及类病毒（一种仅由RNA组成的病毒）等的一小部分。长度为几百~几千个碱基对的长双链RNA，如pre-miRNA（其由mRNA的一部分和与其互补的RNA链组成）和双链RNA病毒等也被发现广泛存在。其中最有前景的应用之一是以小干扰RNA（smallinterfering RNAs，siRNAs）为工具来发挥作用的RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术，其是用于转录后基因调控的有力工具（Nature Genet,2002,32,107-108；EMBO J,2001,20,6877-6888；Proc Natl Acad Sci USA,2002,99,9942-9947.）。近年来RNAi技术被尝试应用于农业（病虫害防治）（Insect Sci,2013,20,4-14；Pest Manag Sci,2016,72,801-809）和水产养殖业（虾病防治）（J Biotechnol,2020,321,48-56；J Virol Methods,2013,188,64-69；IOP Conf Ser Earth Environ Sci,2020,584,012051.）中。但目前dsRNA的大量、高效合成尚未实现，这在很大程度上制约了RNAi农（渔）药、RNAi疫苗的推广使用。因此，亟需建立一种可满足dsRNA高效、低成本、简易制备的方法，以满足科研需求和市场需求。

dsRNA在体内/外均可制备（Anal Bioanal Chem,2018,410,3239-3252）。体内制备（重组过表达）时需要先将用于转录的模板重组到质粒载体当中，然后将其导入大肠杆菌（E.coli）（J. Biotechnol,2020,321,48-56；J Virol Methods,2013,188,64-69；IOP Conf.Ser.Earth Environ Sci,2020,584,012051.）、植物细胞（UK Patent,No.WO2020183416-A1,Sep17,2020）或哺乳动物细胞（Methods Mol Biol,2013,942,291-314.）中进行诱导培养。整个过程需经历表达载体构建、转染、细胞培养、裂解、产物提取纯化（需去除宿主自身的rRNA等杂质）等诸多步骤，较为繁琐；并且胞内机质复杂，产物易被核酸酶降解的同时生物安全性也难以保证。目前这些体内制备技术尚处于研究阶段，未被用于实际生产。