[发明专利]一种制备双链RNA的方法

权利要求书

1.一种制备双链RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，设计并制备环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板含有非互补的泡状结构部分和互补部分，不含启动子序列，所述互补部分与要制备的双链RNA长度相同且序列相同，序列中T对应U，所述泡状结构处于环状双链DNA模板中互补部分的两端，泡状结构的长度为5-15bp，泡状结构的两条链之间连续互补的碱基不超过2个；

步骤二，将制备的环状双链DNA模板纯化，去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA；

步骤三，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行双向滚环转录，核糖核酸酶H则在环状双链DNA模板中泡状结构处DNA的辅助下对含有重复序列的转录产物进行酶切，获得目的双链RNA。

2.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述泡状结构的长度为5-15bp。

3.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为70-1000bp。

4.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为96-278bp。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当所述环状双链DNA模板长度小于90bp时，采用一段法，设计一条成环前体线性DNA链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；

当所述环状双链DNA模板长度大于90bp时，采用一锅法或分步法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；

所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离泡状结构的边缘大于15nt。

6.根据权利要求5所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述退火杂交条件为：先在90℃下保温1-3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20-25℃并保温10min。

7.根据权利要求5所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当使用T4DNA连接酶和相应的T4DNA连接酶缓冲液时，在4-37℃温度范围内保温2-24h进行连接；当使用TaqDNA连接酶和相应的TaqDNA连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。

8.根据权利要求7所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当使用T4DNA连接酶时，采用终浓度为0.05-1×的缓冲液，当缓冲液浓度为1×时，其组成为：40mM Tris-HCl，10mMMgCl₂，10mM DTT，500μM ATP，pH 7.8@25℃；当使用TaqDNA连接酶时，采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：20mM Tris-HCl，25mM KAc，10mM Mg(Ac)₂，10mM DTT，1.0mM NAD，0.1%Triton X-100，pH 7.6@25℃。