[发明专利]一种猪肺炎支原体的灭活方法

说明书

本发明公开了一种猪肺炎支原体的灭活方法，它包括向经超声破碎的猪肺炎支原体菌液中添加二乙烯亚胺(BEI)灭活24～48h。本发明猪肺炎支原体的灭活方法，抗原灭活彻底且耗时短，用本发明灭活的猪肺炎支原体制备的疫苗，蛋白纯度高、免疫应激少、免疫应答高，适宜市场推广使用。

技术领域

本发明具体涉及一种猪肺炎支原体的灭活方法。

背景技术

猪支原体肺炎(MPS)是一种慢性接触性呼吸道传染病，也称为猪气喘病或猪地方性肺炎，其病原最早由Mare、Switzer(1965)和Goodwin等(1965)从患肺炎猪的肺组织中分离出。猪肺炎支原体(Mhp)是MPS的主要病原体，属支原体属，革兰氏染色呈阴性，具有分布广泛，发病率高，致死率低等特点。猪肺炎支原体主要感染家猪，在猪群中主要通过蚊虫叮咬、针头、呼吸撕咬或交配传播，传染率高达80％～90％，极易引起猪群大面积感染甚至死亡。疫苗免疫是猪肺炎支原体诸多防控措施中最重要的措施之一，其中灭活疫苗能使病原体丧失致病性，但仍保留其免疫原性，选择适当的纯化及灭活工艺，能有效提高抗原的免疫原性。

目前我国市场上的猪支原体肺炎活疫苗毒株有168株、RM48株以及兔化弱毒株。一些减毒活疫苗仍保留一定毒力，在一些免疫缺陷的个体中易诱发某些疾病，且对猪群的应激损伤大，操作麻烦，工作量大。而灭活疫苗通过投喂、注射方式，借助血液循环将灭活疫苗抗体送达肺部，可对仔猪体液内与血液循环系统中的猪肺炎支原体进行中和，具有良好的免疫效果。此外，我国陆续研发多联灭活疫苗，实现一针多防，减少了人工劳动力和降低了防控成本。

甲醛是常见的猪肺炎支原体灭活剂之一，其灭活病毒能达到很好的灭活效果，但甲醛为致癌物，残留的游离甲醛随疫苗进入体内后会产生一系列应激反应，在灭活病毒过程中，不仅破坏了病原体的免疫原性，且灭活时间过长。有研究表明用BEI灭活的疫苗在呼吸道发病率、肺部病变记分、饲料转化率、日增重、以及猪血清抗体水平等各项指标均好于甲醛灭活的疫苗，且BEI灭活法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效果及经济效益较甲醛灭活法好，但总体的免疫原性仍不理想。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种猪肺炎支原体的灭活方法，它包括如下步骤：

1)取猪肺炎支原体菌液，浓缩纯化；

2)取步骤1)浓缩纯化后的菌液，超声破碎，加稀释剂稀释，再加二乙烯亚胺(BEI)灭活24～48h，最后加硫代硫酸钠终止灭活。

进一步地，步骤1)所述浓缩纯化是用100～500kDa中空纤维浓缩，离心，沉淀用TNbuffer洗涤2～5次，再-80℃冻融1次。

更进一步地，所述浓缩纯化是用300kDa中空纤维浓缩，离心，沉淀用TN buffer洗涤3次，再-80℃冻融1次。

进一步地，步骤2)所述稀释剂为TN buffer；所述稀释至原猪肺炎支原体菌液体积的1/10～1/100。

进一步地，步骤2)所述超声破碎的功率200W～500W，频率为每超声2～3秒间隔3～4秒，次数为3～5次，每次8分钟。

进一步地，步骤2)所述二乙烯亚胺(BEI)的终浓度为1～5mmol/L，优选3mmol/L。

进一步地，步骤2)所述灭活温度37℃，时间24～48h。

更进一步地，所述硫代硫酸钠的终浓度为1～5mmol/L，优选3mmol/L。

进一步地，所述终止灭活后降温至2～8℃。

本发明猪肺炎支原体的灭活方法，抗原灭活彻底且耗时短，用本发明灭活的猪肺炎支原体制备的疫苗，蛋白纯度高、免疫应激少、免疫应答高，适宜市场推广使用。