[发明专利]miRNA-140的应用及调控斑马鱼颅面骨骼和鳞片发育的方法

说明书

本发明涉及生命科学和生物技术领域，特别涉及一种基于miR‑140基因敲除斑马鱼模型构建方法使其颅面和鳞片发育异常。通过设计miR‑140基因的上下游靶点，利用CRISPR/Cas9技术敲除基因，从而构建miR‑140基因敲除斑马鱼模型。与AB品系野生斑马鱼相比，miR‑140^‑/‑的斑马鱼的头后部鳞片形状发生改变、鳞片变大、颅面骨发育异常，嘴变尖，说明斑马鱼miR‑140调控其鳞片和颅面骨的发育；可进一步研究miR‑140基因作用，对于有鳞鱼与无鳞鱼的进化研究也具有重大意义。

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及一种基于miR-140基因敲除斑马鱼模型构建方法使其颅面和鳞片发育异常。

背景技术

microRNA是内源性的非编码RNA，现已知其控制着生物体内近30％的基因表达，其通过与靶基因的mRNA的3’端非编码区(3’UTR)互补配对，激活靶基因mRNA的降解或阻止其翻译为蛋白质而进行基因的调控，是生物体内非常重要的一类非编码RNA。近些年，CRISPR技术的兴起以及作为强大而便捷的基因修饰编辑技术被广大研究者所追捧，并迅速广泛地应用于人类细胞、果蝇、小鼠、斑马鱼等多种生物进行基因功能的探索以及肿瘤的发生研究等。miR-140在软骨细胞中特异高表达，miR-140最早在斑马鱼中被识别，随后发现其在人和鼠软骨中同样特异性表达。该基因存在于人和鼠的第16号染色体的短臂上，近年来研究发现，它参与软骨细胞的分化且与骨关节炎发病有关系。Miyaki等研究发现，miR-140^-/-小鼠表现出轻微的骨骼表型，包括身材矮小和体重偏轻以及颅面畸形，鼻子短小和圆顶的颅骨。鱼类鳞片作为鱼类的外骨骼，和牙齿、骨骼同源，均是真皮骨架的衍生物，其具有保护鱼类防止外界微生物侵害，降低鱼类游动时水体带来的摩擦损伤，以及维持鱼类特殊体型等重要生物学作用。目前对于斑马鱼鳞片的研究主要集中在形成模式和形态发生研究上，在分子水平上主要是基因敲除EDA、EDAR、FGFRs等与鱼类鳞片相关基因进行研究，但是对参与鳞片发育的miRNA并未有相关文献报道，其研究也对揭示有鳞鱼与无鳞鱼进化上有重要的意义。

发明内容

本发明旨在提供miR-140基因的应用。

本发明提供了敲除斑马鱼miR-140的方法。

本发明的目的还在于以斑马鱼为模型，通过CRISPR/Cas9技术敲除miR-140，从而模拟其在鱼体内对颅面骨和鳞片发育过程的影响。

本发明还提供了一种调控斑马鱼颅面骨发育或鳞片发育的方法。

本发明技术方案为，miRNA-140在调控斑马鱼颅面骨发育或鳞片发育方面的应用。

通过敲除miRNA基因，构建miR-140基因敲除斑马鱼模型，随后利用钙黄绿素染色和micro-ct等方法观察和验证其功能，通过反复对比和观察，发现miR-140^-/-的斑马鱼和AB品系野生斑马鱼相比，其头后部鳞片形状发生改变、鳞片变大、颅面骨发育异常，嘴变尖，说明斑马鱼miR-140能够调控其鳞片和颅面骨的发育。

一种调控斑马鱼颅面骨发育或鳞片发育的方法，具体为，敲除斑马鱼的miRNA-140基因或者增强miRNA-140基因的表达。

敲除斑马鱼的miRNA-140基因后，斑马鱼头后部鳞片形状发生改变、鳞片变大、颅面骨发育异常，嘴变尖。增强斑马鱼miRNA-140基因的表达，一种构建颅面和鳞片发育异常的斑马鱼模型的方法，具体为，敲除斑马鱼的miRNA-140基因。具体步骤包括：

(1)敲除斑马鱼的一细胞期受精卵中的miRNA-140基因，获得miR-140基因敲除的斑马鱼杂合子F0代；

(2)将F0代与AB型野生斑马鱼杂交获得F1代，经基因测序，获得miR-140基因缺失的杂合子；