[发明专利]一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法

说明书

本发明公开了一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法。属于金属离子成像技术领域，具体步骤：体外筛选镁离子依赖的具有RNA切割活性的TNA分子；对筛选获得的TNA分子序列进行活性测试及截短分析；选择其中活性最高的TNA分子进行生物化学表征；将TNA分子切割体系构建为镁离子荧光传感器；在体外缓冲液中验证该荧光传感器的性能；将该传感器转染至细胞中进行体内镁离子的成像。本发明可以有效地在体外对不同浓度的镁离子进行荧光响应，检测限达到0.35mM，并且可在活细胞内对镁离子进行荧光成像，比利用天然核酸进行检测的方法更稳定，更耐核酸酶的降解，为分子生物学提供了新的工具。

技术领域

本发明属于金属离子成像技术领域，涉及一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，特别是涉及一种体外筛选可切割RNA的TNA分子用于细胞内镁离子成像的方法。

背景技术

镁离子是哺乳动物体内含量最丰富的二价阳离子，具有广泛的生物学作用。镁离子通过与细胞内的蛋白质，核酸或膜结构相互作用来发挥如功能代谢，信号传导及结构组成等重要的生物学作用，因此对细胞内镁离子的成像和检测是非常重要的。由于天然核酸在金属配体领域得到了广泛研究，目前已有研究通过体外筛选的方法获得了可以在金属离子的激活下，特异型切割RNA的DNA酶，由于筛选获得的8-17脱氧核酶在锌离子和铅离子的激活下比镁离子更活跃，因此8-17用于检测环境中的铅离子以及细胞内的锌离子。由于天然核酸在细胞内容易受到核酸酶的降解，因此目前尚未有天然核酶直接用于细胞内镁离子的检测。苏糖核酸(TNA)是一种RNA类似物，它可与DNA或RNA形成稳定的双螺旋结构，同时能够储存和传递遗传信息。由于其化学结构简单，与天然核酸不同的单体连接方式，使其更耐核酸酶的降解，在细胞环境中更能稳定的发挥作用。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供了一种基于苏糖核酸(TNA)分子的细胞内镁离子成像的方法，特别是一种体外筛选可切割RNA的TNA酶用于细胞内镁离子成像的方法。

技术方案：本发明所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法：

(1)、体外筛选镁离子依赖的具有RNA切割活性的TNA分子；

具体操作方法是：

首先，合成初始DNA分子随机文库和引物，然后进行循环筛选；在每一轮筛选里，采用引物延伸的方法获得TNA文库；

然后，通过链霉亲和素分离得到包含RNA底物和TNA分子的单链文库，该文库在含有镁离子的缓冲液中进行孵育，在TNA分子的催化下，具有切割活性的TNA分子会催化底物发生断裂，使TNA分子从磁珠上被洗脱下来；

最后，被洗脱的TNA分子经过逆转录和PCR扩增后，获得富集的DNA分子文库，应用于下一轮筛选；如此重复筛选多轮，逐渐加大筛选压力，镁离子浓度由20mM降低到1mM，孵育时间由18h降低到1h，以获得高活性的TNA分子(对富集的DNA分子进行测序，并根据测序结果推断得到TNA分子的序列信息。最后制备单链TNA分子，测试其在镁离子存在时的催化活性，具有RNA切割活性的TNA分即为苏糖核酶)；

(2)、对筛选获得的TNA分子序列进行活性测试及截短分析(测试TNA分子的活性)；具体步骤如下：

首先，对筛选结束后富集的DNA分子文库进行测序，并根据测序结果推断于其互补的TNA分子的序列信息；

然后，通过引物延伸反应和链分离制备单链TNA分子；

最后，在反应缓冲液中加入RNA底物和TNA分子，孵育后通过电泳的方式测试其催化活性；

(3)、选择其中活性最高的TNA分子进行生物化学表征；