[发明专利]一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法

权利要求书

1.一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，其具体操作步骤如下：

(1)、体外筛选镁离子依赖的具有RNA切割活性的TNA分子；

(2)、对筛选获得的TNA分子序列进行活性测试及截短分析；

(3)、选择其中活性最高的TNA分子进行生物化学表征；

(4)、将TNA分子切割体系构建为镁离子荧光传感器；

(5)、在体外缓冲液中验证该荧光传感器的性能；

(6)、将该传感器转染至细胞中进行体内镁离子的成像。

2.根据权利要求1所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，

在步骤(1)中，所述体外筛选镁离子依赖的具有RNA切割活性的TNA分子具体操作方法是：

首先，合成初始DNA分子随机文库和引物，采用引物延伸的方法获得TNA文库；

然后，通过链霉亲和素分离得到包含RNA底物和TNA分子的单链文库，该文库在含有镁离子的缓冲液中进行孵育，具有切割活性的TNA分子会催化底物发生断裂，使TNA分子从磁珠上被洗脱下来；

最后，被洗脱的TNA分子经过逆转录和PCR扩增后，获得富集的DNA分子文库，应用于下一轮筛选；重复筛选多轮，加大筛选压力，镁离子浓度由20mM降低到1mM，孵育时间由18h降低到1h，以获得高活性的TNA分子。

3.根据权利要求1所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，

在步骤(2)中，所述对筛选获得的TNA分子序列进行活性测试的具体步骤如下：

首先，对筛选结束后富集的DNA分子文库进行测序，并根据测序结果推断于其互补的TNA分子的序列信息；

然后，通过引物延伸反应和链分离制备单链TNA分子；

最后，在反应缓冲液中加入RNA底物和TNA分子，孵育后通过电泳的方式测试其催化活性。

4.根据权利要求1所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，

在步骤(3)中，所述活性最高的TNA分子具体是指：通过截短实验和蛇毒磷酸二酯酶处理后，从而获得的活性最高的TNA分子，其序列如下所示：

5’-GTAGGAGAGGTTATCGTTGGAGGGAGATGAGTGTAG-2’。

5.根据权利要求1所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，

在步骤(4)中，所述构建镁离子荧光传感器具体是：

在RNA底物的5’端和3’端分别标记荧光基团FAM和猝灭基团BHQ-1，当镁离子不存在时，荧光被猝灭；当镁离子存在时，TNA分子催化RNA底物断裂，荧光基团被释放，荧光信号恢复。

6.根据权利要求1所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，

在步骤(5)中，所述在体外缓冲液中验证该荧光传感器的性能具体表现如下：

当镁离子浓度小于20mM时，体系的荧光信号强度与镁离子浓度呈现线性关系，检测限为0.35mM。

7.根据权利要求1所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，

在步骤(6)中，所述将该传感器转染至细胞中进行体内镁离子的成像步骤如下：

首先，利用转染试剂Lipofectamine 3000将荧光传感器转染至细胞内；

然后，利用钙离子载体将培养基中的镁离子运输至细胞内；

最后，细胞孵育后利用共聚焦显微镜进行成像。

8.根据权利要求1和7所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，

在步骤(6)中，所述该传感器体内镁离子的成像的性能表现如下：

该检测方法可在活细胞内对20mM浓度的镁离子进行荧光成像。