[发明专利]胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法

说明书

本发明涉及一种胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法，从围产期胎盘组织中分离培养自然杀伤细胞(NK细胞)的方法包括如下步骤：①取围产期胎盘组织，以小块的形式剪下绒毛小叶结构组织；②利用I、II型胶原酶、DNA酶消化胎盘小叶组织；③利用密度梯度离心的方法提取消化后细胞悬液中的单个核细胞；④利用IL‑15、FLT3‑L、OK432等细胞因子诱导培养单个核细胞中的NK细胞扩增；⑤扩增后的NK细胞的生物学鉴定。本发明方法呈现如说明书所述优良技术效果。

技术领域

本发明涉及一种从胎盘绒毛小叶组织来源细胞的培养扩增自然杀伤细胞的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

自然杀伤细胞(NK细胞)于30年前在外周血中被发现，CD3-CD56+淋巴细胞被定义为人NK细胞。NK细胞通常含有大量穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)，当激活的NK细胞遇到靶细胞时，NK细胞释放穿孔素和颗粒酶B攻击靶细胞。NK细胞还可以分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-3等细胞因子，这些细胞因子可以直接作用于靶细胞，也可以通过激活其他种类的免疫细胞攻击靶细胞。

有文献(Koepsell SA,Miller JS,McKenna DH Jr.Natural killer cells:areview of manufacturing and clinical utility.Transfusion.2013,53(2):404-10)报道，浸润到肿瘤组织中的NK细胞数量尽管非常少，但是NK细胞浸润到肿瘤组织的患者能明显的观察到其生存期的显著延长，及其肿瘤扩散比率的显著降低。与健康人的NK细胞相比，肿瘤患者NK细胞浸润到肿瘤组织中的杀伤能力显著降低。

另外，肿瘤患者的NK细胞表面抑制受体如CD158a、CD158b和NKG2A表达显著上升，而激活受体如NKG2D、NKG2C、NPp30和CD69则显著下降。现有研究数据表明，癌症患者的NK细胞严重受损，这使得它们无法消灭肿瘤细胞。但这为肿瘤的免疫治疗提供了一个契机，即通过体外细胞活化和扩增的方法恢复或者重建NK细胞抗肿瘤的能力，提高NK细胞对肿瘤免疫治疗的效果。已经报道的许多临床前研究表明，NK细胞作为一种有效地免疫治疗方法可以用于治疗各种肿瘤。

一些NK细胞临床研究的细胞制备方法已经有可能被转化成为临床级或者是cGMP级的标准制备过程(Lapteva N,Durett AG,et al.Large-scale ex vivo expansion andcharacterization of natural killer cells for clinicalapplications.Cytotherapy.2012,14(9):1131-43)。在这些报道的NK细胞制备方法中，大多使用外周血、脐血、骨髓中的单个核细胞作为培养NK细胞的样本。另外，还有文献(Campbell KS,Hasegawa J.Natural killer cell biology:an update and futuredirections.J Allergy Clin Immunol.2013,132(3):536-44)报道，体外扩增NK细胞，有多种因素都会影响到NK细胞的数量，从而降低NK细胞扩增的可能性。

胎盘作为连接胎儿和母体的重要器官，其结构较为复杂，至少可分为胎盘脐带连接、羊膜包被层、绒毛膜板、绒毛组织、底蜕膜等包含不同种类细胞的组织。现有研究表明，同一份胎盘至少可以获得包括造血(祖)干细胞、绒毛血管内皮干细胞以及绒毛膜、羊膜以及绒毛组织来源的间充质干细胞等不同种类的细胞。胎盘在胎儿发育早期也是重要的造血器官，研究表明，绒毛及其绒毛小叶结构中血管成分来源的内皮干细胞和造血祖细胞，在造血过程起着重要作用。在胎盘发育早期存在造血内皮组织，主要存在绒毛小叶结构之中，胎盘小叶结构中的血管内皮在一定条件下可以从血管内皮脱落、或造血内皮细胞失去表达钙黏素5发育成为血液中的悬浮细胞，成为具备造血分化功能的干细胞。