[发明专利]胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法

权利要求书

1.培养自然杀伤细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将细胞密度为（0.5~1.5）×10⁶/mL的胎盘MNC细胞悬液20mL接种至一个T75培养瓶中，然后向培养瓶中添加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK432 10ng/mL、氯化亚铁5µg/ml和苏氨酸60µg/ml，混匀后将培养瓶置于37℃、5% CO₂培养箱中培养；

(2)每48h向培养瓶中补加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK432 10ng/mL、氯化亚铁5µg/ml和苏氨酸60µg/ml，每48～72h向培养瓶中补加NK细胞完全培养基，并调整细胞密度为（0.5～1.5）×10⁶/mL，当培养的细胞悬液总体积达到200ml时，将细胞悬液转移至G-rex培养瓶中继续培养至14天；

(3)培养结束后，将细胞悬液吸出至离心瓶中，1500rpm、8min、25℃离心；结束后弃上清液，用PBS重悬细胞沉淀，得到自然杀伤细胞。

2.根据权利要求1的方法，所述NK细胞完全培养基是以X vivo 15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5%的Helios®血清替代物、1mM酪氨酸、2mM的L-谷氨酰胺。

3.根据权利要求1的方法，所述PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。

4.根据权利要求1的方法，所述胎盘MNC细胞悬液是照包括如下步骤的方法制备得到的：

(i)将胎盘小叶组织细胞沉淀用PBS重悬，充分混匀后，置于50ml离心管中，每管20ml；另准备若干50mL离心管，向每管内添加20ml的密度为1.077g/ml的聚蔗糖分离液，再将胎盘小叶组织细胞悬液用移液管小心的加到聚蔗糖分离液的上方，并不要扰乱两溶液之间的分层，每管终体积为40ml；

(ii)将离心管放入离心机中，将离心机的升速/降速均设置为0，进行600g、20min、4℃离心；离心结束后，离心管内的细胞悬液从上至下应分为4层：分别为PBS层、单个核细胞层、聚蔗糖分离液层、胎盘小叶细胞层；用移液管将上层PBS吸弃后，使用一次性巴氏滴管小心的吸取中间的单个核细胞层至一新的50ml离心管中，每管悬液不超过10ml，然后用PBS补齐至40ml，放入离心机中进行1400rpm、5min、4℃离心；

(iii)离心结束后，弃去上清液，再次用PBS重悬细胞沉淀，并定容至40ml，进行第二次1400rpm、5min、4℃离心；离心结束后，弃去上清液，沉淀用NK细胞完全培养基重悬细胞沉淀，得MNC细胞悬液；

其中，步骤(i)所述胎盘小叶组织细胞沉淀是照如下步骤的方法制备得到的：

(a)胎盘清洗：使用手术镊将胎盘组织取出，放入不锈钢托盘中，用含青霉素-链霉素-两性霉素的组织清洗液对胎盘表面进行冲洗，去除表面上的凝血污渍；

(b)用剪刀、镊子钝性剥离并丢弃胎盘表面的羊膜层，剪去其上的脐带组织；然后用剪刀将剩余的胎盘小叶组织剪成3~7cm³的小块，在250ml离心杯中添加25～30mL的HBSS缓冲液，将剪后的胎盘组织小块放入离心杯中，用剪子将小叶组织进一步剪碎成0.5～1mm³的大小，然后转移至300目筛网上，用HBSS缓冲液进行过滤，并使用HBSS缓冲液再清洗两次，清洗至滤液清澈；将清洗后的组织加入已预热至37℃的组织消化液100mL中，充分混匀，用封口膜封口后，于37℃、100rpm的摇床中振荡消化30min；

(c)消化结束后，将装组织消化液的离心杯放入安全柜，倒入组织清洗液，使用300目滤网过滤；再用400ml组织清洗液多次洗涤组织，收集滤清液；将滤清液倾倒入若干250mL离心杯中，放入离心机，进行1500rpm、8min、25℃离心；离心结束后，弃上清液，再次用组织清洗液重悬细胞沉淀，充分混匀后再次以1500rpm、8min、25℃离心；

(d)离心结束后，弃上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞悬液，至50ml离心管中，以1800rpm、10min、25℃离心，离心结束后弃上清液，收集细胞，得到胎盘小叶组织细胞沉淀。