[发明专利]一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法

说明书

本发明提供一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法，涉及免疫组库测序文库的扩增制备技术领域。淋巴细胞裂解和总RNA提取：步骤一、将样本预处理后，进行RNA提取；步骤二、逆转录：对获得的淋巴细胞的总RNA进行逆转录，获得cDNA；步骤三、多重PCR：通过对cDNA进行第一轮PCR和第二轮PCR，对cDNA的TCRβ链基因进行特异性扩增；步骤四、添加测序接头序列及index，构建文库较短，但包含完整的CDR3区段，可以获得更高的通量，更低的价格，每条特异性引物的添加量与扩增体系都是经过大量实验优化后确定的，本发明可以极大降低引物二聚体的数量，获得高质量文库。

技术领域

本发明涉及免疫组库测序文库的扩增制备技术领域，具体为一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法。

背景技术

免疫组库(Immune Repertoire，IR)是指在任何指定时间，个体的循环系统内所有功能多样性B细胞和T细胞的总和，免疫系统的多样性对机体健康至关重要，其多样性越丰富，机体的免疫系统就越健康，识别并清除抗原的能力就越强，机体的获得性免疫能识别无数种抗原分子，并随之做出反应，其分子基础为T细胞表面受体和B细胞表面受体(TCR和BCR)特异性识别抗原区段，激活免疫应答，免疫系统中T细胞库和B细胞库分别包含了所有特异性不同的T细胞克隆和B细胞克，这种识别受体的多样性在基因重排过程中产生，多样性体现为受体基因V(D)J片段重组，TCRβ基因群可变区包括V β、Dβ、Jβ三类基因片段，TCRα基因群包括Vα、Jα两类基因片段，不同基因片段及不同链的组合可产生1016种可能性，因此分析多样性主要是分析 V(D)J片段的序列特征。

目前关于免疫组库NGS制备技术包括多重PCR与5’RACE(Rapid Amplification ofcDNA Ends)，其中RACE法在逆转录、TdT加尾、PCR扩增这三个连接的酶促反应过程中，任何一步的失败都会导致前功尽弃，即便是上述反应平稳顺利，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物，且成本较高，相比之下，多重PCR建库简单易行、成本低等优点便体现出来，成为免疫组库建库的优选方法，但是多重PCR存在一个弊端就是不同引物之间会形成引物二聚体，且引物对数越多，二聚体现象越严重，这就大大降低了引物的扩增效率。而且，引物对数越多，实验成本就越高，难度也越大，目前国内外关于免疫组库的制备无非两种，一种是全引物扩增，而TCR 的可变区V区基因有152个，采用传统的多重PCR扩增技术路线，需要上百对引物，这无疑为免疫组库的扩增制备增添了很多困难和成本，后一种就是局部扩增，采用一部分V区引物扩增，利用局部检测整体，而这种方法很容易对结果造成偏差，且随机性太强，可重复性差，实验结果不稳定，因此本发明利用一种独特的计算机算法针对152个V基因设计出43对简并引物，通过一系列的实验条件优化，实现了利用少量引物全覆盖扩增humanTCRβ链测序文库。

发明内容

本发明提供的发明目的在于提供一种采用少量简并引物全面扩增 humanTCRβ链文库的制备方法。

通过独特的计算机算法针对152个V基因设计出43对简并引物，并对实验条件优化，实现了利用少量引物全覆盖扩增humanTCRβ链测序文库。

为了实现低成本、全面扩增humanTCRβ链CDR3文库。

本发明提供如下技术方案：一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法，包括以下步骤：

S1、淋巴细胞裂解和总RNA提取：将样本预处理后，进行RNA提取；

S2、逆转录：对获得的淋巴细胞的总RNA进行逆转录，获得cDNA；

S3、多重PCR：通过对cDNA进行第一轮PCR和第二轮PCR，对cDNA的TCR β链基因进行特异性扩增；

S4、添加测序接头序列及index；