[发明专利]一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法

权利要求书

1.一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、淋巴细胞裂解和总RNA提取：将样本预处理后，进行RNA提取；

S2、逆转录：对获得的淋巴细胞的总RNA进行逆转录，获得cDNA；

S3、多重PCR：通过对cDNA进行第一轮PCR和第二轮PCR，对cDNA的TCRβ链基因进行特异性扩增；

S4、添加测序接头序列及index；

S5、测序结果分析：高通量测序完成后，使用fastq文件进行数据分析，采用以MIXCR为核心的独特的分析工具将测序结果比对到T细胞受体的V、D、J、C基因参考序列上，利用前一步骤获得的比对结果拼接clonotypes，输出比对结果，最后生成免疫组库多样性图谱。

2.根据权利要求1所述的一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法，其特征在于，根据S1中的操作步骤，包括以下步骤：

S101、取250μL血液转移至1.5mL的RNase-free离心管中，加入750μL裂解液，反复吹打，并剧烈振荡混匀后，室温静置5min；

S102、加入200μL氯仿，剧烈振荡15sec混匀后，制得样品，室温静置2min；

S103、将样品置于离心机中，使混合溶液分层，取上层水相转移至1.5mL的RNase-free离心管中，加入0.5倍体积无水乙醇，颠倒混匀，获得预处理混合液；

S104、将RNA吸附柱套入2mL收集管中，将预处理混合液加入到RNA吸附柱中，离心，弃掉废液；

S105、加入500μL去蛋白液，离心，弃废液；

S106、将RNA吸附柱放回收集管，加入500μL漂洗液，室温离心30sec，弃废液，重复循环一次；

S107、将RNA吸附柱放回收集管，空柱室温离心2min，除去残留的漂洗液；

S108、将RNA吸附柱放入新的1.5mL RNase-free离心管中，RNase-freeH₂O洗脱，室温放置2min，然后通过离心1min，收集滤液，即为RNA溶液，然后通过离心1min，收集滤液，即为RNA溶液。

3.根据权利要求2所述的一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法，其特征在于，所述离心机设置温度为4℃，转速为12000rpm，离心10min。

4.根据权利要求1所述的一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法，其特征在于，根据S2中的操作步骤，包括以下步骤：

S201、在RNase-free离心管中配置混合液，将配置的混合液，在温度为65℃的温度下，加热5min，迅速置于冰上骤冷；

S202、配制第一链cDNA合成反应液，用移液器轻轻吹打混匀后，进行第一链cDNA合成反应。

5.根据权利要求4所述的一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法，其特征在于，所述混合液为RNase-freeddH₂O、Gene-Specific-Primers和TotalRNA混合制得混合液。

6.根据权利要求4所述的一种采用少量简并引物全面扩增humanTCRβ链文库的制备方法，其特征在于，所述第一链cDNA合成反应液为混合液、2×RTMix和EnzymeMix混合制得。