[发明专利]一种融合蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种融合蛋白及其制备方法与应用。所述融合蛋白包括GSDME突变蛋白和肿瘤细胞特异性穿膜肽；所述GSDME突变蛋白中将GSDME蛋白中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶识别的序列突变为基质金属蛋白酶识别的氨基酸序列提供对肿瘤的靶向作用；通过半胱氨酸突变为丙氨酸降低GSDME蛋白在体外的错误折叠率，增加其成药的可能性。构建了具有肿瘤靶向性和穿透性以及肿瘤微环境特异性激活的融合蛋白，为抗癌靶向药的开发提供了新的思路；能够直接将焦亡组件GSDME的N端送入肿瘤细胞内诱导焦亡并且通过激活机体自身免疫从而提高其他抗肿瘤免疫疗法的敏感性，扩大了现有抗肿瘤免疫疗法的效率和适用范围，具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种融合蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

GSDME基因，又名DFNA5，编码496个氨基酸，含有一个焦孔素gasdermin结构域，属于gasdermin家族成员之一。GSDME蛋白由两个不同功能的结构域组成，N端具有膜穿孔活性C端通过与N端的域-域之间相互作用，维持其构象稳定和转变，进而发挥自抑制及调控细胞焦亡的生物学功能。

细胞焦亡是一种“燃烧式”伴随炎症反应的程序性细胞死亡，由炎症小体或LPS等激活炎症性含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)或颗粒酶(Granzyme)切割gasdermin，使其形成N端和C端结构域，N端自组装成桶装结构直接与膜脂结合诱发膜穿孔，破坏细胞内渗透压，导致细胞膨胀，释放乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，引起炎症反应；同时，伴随细胞因子白介素IL-1和IL-18的释放，导致进一步的炎症反应。在生理条件下，GSDME能够被Caspase-3/Granzyme B切割激活，从而导致细胞凋亡向细胞焦亡转换。早在十几年前，研究表明，GSDME的启动子在多种肿瘤细胞中被甲基化，这一表观修饰抑制了其在肿瘤细胞中的表达；GSDME能抑制胃癌、黑色素瘤、结直肠癌等肿瘤细胞集落形成和增殖；GSDME水平的降低与乳腺癌死亡率上升有关。这些线索提示GSDME是一种肿瘤抑制因子。近年的随着GSDME在细胞焦亡中的作用被发现后，越来越多研究证实GSDME是一种有效的抑癌基因，但在大部分肿瘤组织中沉默表达或发生突变导致功能缺失，当激活肿瘤中的GSDME时，它可以将免疫系统无法识别的“冷”肿瘤转变为免疫系统可以控制的“热”肿瘤。

肿瘤有多种方法逃避免疫系统的攻击，而科学家们也通过癌症免疫疗法进行了反击，目前其中主要方法是使用免疫检查点抑制剂，另一种方法是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)。但是，并非所有肿瘤患者都能通过这些方法进行治疗，研究显示这些方法仅对少数癌症类型有效，大部分肿瘤都属于“冷”肿瘤，导致这些免疫疗法存在一定的局限性。GSDME是启动细胞焦亡和先天免疫调控的分子开关，选择融合蛋白的方法启动细胞焦亡，是因为与小分子药物相比，蛋白质药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确、原核或真核表达使生产方便，有利于大规模生产和临床应用。本发明根据GSDME的作用机制，使用融合表达的方式构建了肿瘤靶向激活细胞焦亡的蛋白质类药物系统，并使用一系列功能学实验验证了TRAP诱导焦亡的有效性。

发明内容

本发明第一方面的目的，提供一种GSDME突变蛋白。

本发明第二方面的目的，提供本发明第一方面所述的GSDME突变蛋白的相关生物材料。

本发明第三方面的目的，提供一种融合蛋白。

本发明第四方面的目的，提供本发明第三方面所述的融合蛋白的相关生物材料。

本发明第五方面的目的，提供本发明第三方面所述的融合蛋白的制备方法。

本发明第六方面的目的，提供本发明第一方面所述GSDME突变蛋白或本发明第二方面所述相关生物材料或本发明第三方面所述的融合蛋白或本发明第四方面所述的相关生物材料的应用。

本发明第七方面的目的，提供一种产品。