[发明专利]一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法及其应用，方法包括如下步骤：S1、提取转基因阳性样本全基因组，然后加入Tn5转座酶进行打断建库，得到第一混合物；S2、采用带有barcode序列的引物，经PCR扩增所述第一混合物，得到带有不同barcode序列的第二混合物；S3、纯化所述带有不同barcode序列的第二混合物，然后将纯化后的第二混合物均一混合后，进行高通量测序；S4、对高通量测序数据进行数据分析，鉴定获得转基因元件的插入位点信息；本方法建库流程简单：采用Tn5转座酶建库，流程简单快速；成本低廉：可以进行多样品混测，并且是利用PCR扩增反应靶向富集目标序列侧翼序列，对于测序量要求不高，1G测序量的成本能满足分析几十个样品的分析需求。

技术领域

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法及其应用。

背景技术

在动植物基因功能研究和分子育种中，为了研究基因的功能，人们经常会利用转基因或基因编辑技术，对动植物体内的目标基因进行改造和定向编辑。然而，利用这些转基因技术，必然会将外源片段插入到宿主的基因组内，同时鉴定这些转基因元件的具体情况和信息，对于基因功能研究和分子育种的应用影响很大。

目前出现很多不同的方法鉴定转基因元件的插入位点，如反向PCR技术，其是利用限制性内切酶酶切含有已知标签序列的DNA，使DNA片段含有特异的粘性末端，再通过DNA连接酶使酶切后的DNA片段连接成环，之后，根据已知标签序列设计一对反向引物，对环状DNA进行PCR扩增，最终得到的产物即为含有标签序列侧翼的未知序列，但是该技术存在DNA酶切后环化效率不高、有些物种没有合适内切酶使用等问题。另外一种鉴定方法为热不对称交错PCR(Tail-PCR)技术，该技术涉及3套特异性引物和一个具有低退火温度的低特异性的简并引物进行组合，通过三轮热不对称的PCR反应，来大量富集所需要的片段，随后对PCR产物进行Sanger测序，从而获得已知标签序列的侧翼序列，但该方法存在PCR扩增繁琐、非特异性产物较多等诸多问题。近年来，基于高通量测序的全基因组重测序发展越来越迅速，该方法通过进行全基因比对，即可获得目标序列的侧翼序列、拷贝数等信息，并且该方法简单高效，但是需要全基因测序，成本较高，难以大规模的使用。

有鉴于此，有必要开发一种可以高效低成本的实验方法和分析流程，可以快速的鉴定多样品的转基因元件插入位点情况。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法及其应用。本发明基于高通量测序技术能快速鉴定转基因元件的插入位点，从而可以实现高效低成本的对多个样品的转基因元件的插入位点和拷贝数进行鉴定分析。

本发明的一个目的在于提供一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法。

一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法，包括如下步骤：

S1、提取转基因阳性样本全基因组，然后加入Tn5转座酶进行打断建库，得到第一混合物；

S2、采用带有barcode序列的引物，经PCR扩增所述第一混合物，得到带有不同barcode序列的第二混合物；

S3、纯化所述带有不同barcode序列的第二混合物，然后将纯化后的第二混合物均一混合后，进行高通量测序；

S4、对高通量测序数据进行数据分析，鉴定获得转基因元件的插入位点信息。

进一步地，步骤S1中，在所述Tn5转座酶打断建库的过程中，添加接头序列，使打断后的基因组的两侧分别加上接头。

该步骤中，利用Tn5转座酶在打断建库的过程中，可以对基因组边打断边加入接头的特点，使打断后的基因组的两侧分别加上接头，为后续PCR建库提供条件。

进一步地，所述接头序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。