[发明专利]鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法、重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法

说明书

本发明属于兽用制品领域，公开了一种鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法，包括如下步骤：步骤1：构建亚基因组质粒，所述亚基因组质粒为质粒pF1、pF2、pF3、pF4，质粒pF1、pF2、pF3、pF4分别含目标片段F1、F2、F3、F4；步骤2：获取目标片段：从质粒pF1、pF2、pF3、pF4上获取用于体外连接的目标片段f1、f2、f3、f4；步骤3：体外连接目标片段f1、f2、f3、f4，获得鸭坦布苏病毒感染性cDNA。该方法可以成功的克隆出与原病毒株完全相同、无突变的重组病毒。

技术领域

本发明涉及兽用制品领域，具体为一种鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法、重组 病毒rDTMUV-QY21的制备方法。

背景技术

2010年4月，中国各地的许多养鸭场爆发了一种新的疾病。该病特征症状包括食欲下 降、产蛋下降、卵巢的充血、出血、变性、退化以及淋巴细胞浸润，严重病例可致死亡。 经病毒的分离与鉴定，确定引起该病的病原为一种新的黄病毒，命名为鸭坦布苏病毒(DuckTembusu Virus，DTMUV)。近能年来，以生长迟缓和产蛋量下降为特征的鸭坦布苏病毒病 已在中国的养鸭区域出现大面积传播，并对中国的水禽养殖业造成了巨大的经济损失。然而，目前市面上针对该病毒的疫苗仍以传统灭活疫苗为主。该疫苗的保护效价并不十分理想以至于需要重复接种，因此给养鸭行业造成较重的经济负担。

通过建立DTMUV重组平台将为进一步快速创制应对各种流行毒株的新型疫苗打下坚 实基础，并为深入研究该病毒与宿主的相互作用，免疫和致病机制提供切实有用的工具。

DTMUV属于黄病毒属，黄病毒科。其基因组只有一个长的独立开放阅读框，编码3个结构蛋白：核衣壳(C)、膜(M)和包膜(E)；以及7个非结构蛋白：NS1、NS2A、 NS2B、NS3、NS4A、NS4BNS5。

本申请所要解决的技术问题是：如何快速建立鸭坦布苏病毒QY21株感染性cDNA，为进一步开发针对鸭坦布苏病毒的新型疫苗提供平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法以及重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法，该方法可以成功的克隆出与原病毒株完全相同、无突变的重 组病毒。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备 方法，包括如下步骤：

步骤1：构建亚基因组质粒，所述亚基因组质粒为质粒pF1、pF2、pF3、pF4，质粒pF1、pF2、pF3、pF4分别含目标片段F1、F2、F3、F4；

步骤2：获取目标片段：从质粒pF1、pF2、pF3、pF4上获取用于体外连接的目标片段f1、f2、f3、f4；

步骤3：体外连接目标片段f1、f2、f3、f4，获得鸭坦布苏病毒感染性cDNA；

目标片段F1/f1的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为1-3490；

目标片段F2/f2的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为3471-6599；

目标片段F3/f3的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为6580-10599；

目标片段F4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为8162-10990；

目标片段f4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为10580-10990。

在上述的鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法中，所述步骤1具体为：

步骤11：利用引物Vector-F、Vector-R以pBR322-Base为模板，通过PCR扩增pBR322载体，然后经胶回收备用，得到的pBR322-Base-T7pro；