[发明专利]一种碱性嗜热鼠李糖苷酶在制备活性生物黄酮中的应用

说明书

本发明涉及一种碱性嗜热鼠李糖苷酶，使用该碱性嗜热鼠李糖苷酶在高温条件和不同pH条件下进行黄酮类化合物的生物转化具有很高的转化率，所述高温条件为60‑100℃，所述不同pH条件为5‑11，对黄酮类化合物的转化率可达98.5％以上。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及一种碱性嗜热鼠李糖苷酶在制备活性生物黄酮中的应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC3.2.1.40)是一种特异性地水解聚糖或者糖苷类化合物末端的α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1、α-1,6糖苷键，释放L-鼠李糖，产生新的聚糖或糖苷类化合物的水解酶。α-L-鼠李糖苷酶在自然界的来源广泛，该酶可从细菌、酵母、真菌、植物和动物组织中分离获得。目前已报道大多数α-L-鼠李糖苷酶来源于微生物，其中，已表征的细菌源GH78家族α-L-鼠李糖苷酶有19个，大多数来源于革兰氏阳性细菌，包括芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、梭菌属、链霉菌属和热微菌门属。CAZY数据库根据氨基酸序列相似性对糖苷水解酶进行分类，微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶包含在GH13、GH28、GH78和GH106糖苷水解酶家族中。

α-L-鼠李糖苷酶在食品生产、医药加工和化工等方面具有好的开发前景和应用价值。作为生物催化剂，α-L-鼠李糖苷酶可以通过水解柑橘类果汁中的柚皮苷而用于果汁的脱苦、水解萜烯类糖苷增强葡萄酒的香气、水解橙皮苷使果汁澄清、水解芦丁提高黄酮类化合物的生物利用度及生物学活性，此外也可以通过α-L-鼠李糖苷酶的反向水解合成α-L-鼠李糖苷。α-L-鼠李糖苷酶可以将人参皂苷、柴胡皂苷C和薯蓣皂苷等常用中药材中的皂苷类化合物转化成活性成分。还可用于特异转化柚皮苷成为极具活性的普鲁宁。此外，α-L-鼠李糖苷酶可水解许多天然药材成分末端的α-L-鼠李糖基，水解产物为生物活性异槲皮素(enzymatically modified isoquercitrin,EMIQ)合成的关键前体，且已被批准为多种食品添加剂。

黄酮类化合物是一类广泛分布于植物中具有2-苯基色原酮结构的多酚类天然产物。研究已表明：黄酮类化合物具有多种多样的生理和药理功效，包括抗氧化作用、降血糖和血压、消炎、抗肿瘤作用、抑菌抗病毒作用、治疗心血管疾病、调节肠道菌群等等。天然黄酮类化合物通常以糖苷形式稳定存在。这类黄酮类化合物往往含有一个或者多个鼠李糖基(包括黄酮3位以及7位)，较为常见的有芦丁、柚皮苷、橘皮苷、新橙皮苷以及朝藿定C等。该系列黄酮化合物中，鼠李糖基的存在影响了它们的溶解性以及生物活性。去除鼠李糖苷可以显著地提高天然黄酮的生物利用率，最大程度发挥其生物学功效。酶法水解具有温和、高效、专一等特点，适合用于鼠李糖苷类黄酮化合物的水解，因而，高催化活性的黄酮鼠李糖苷水解酶具有巨大的应用潜力。

然而绝大部分黄酮类物质作为底物，水溶性和脂溶性溶解性很差，仅溶于热的稀碱溶液或某些有机助溶剂(譬如：甲醇)，因此大大限制了鼠李糖苷酶的工业化应用。目前的鼠李糖苷酶的酶转化和最适条件如专利申请CN202110690007.0记载的细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶，最适pH是7，最适温度为50℃，专利申请CN201910435031.2转化反应在pH6.0和37℃下进行,专利申请CN201810110773.3转化反应在温度40℃-60℃，pH5.0-7.5条件下,CN201610635941.1最适温度为60℃,最适pH为5.0，这些现有技术均难以实现较高温度以及较碱性的环境下的黄酮类物质酶法转化。因此为弥补现有技术的不足，突破黄酮类物质溶解度的限制，需要一种耐高温稳定且能够在碱性条件下具有高活力的鼠李糖苷酶，以利于黄酮物质的转化。

发明内容

本发明开发了一种在高温条件和不同pH条件下进行黄酮类化合物的酶转化的方法，所述高温条件为60-100℃，优选80℃；所述不同pH条件为pH 5-11，优选为碱性条件pH8-10，对黄酮类化合物的转化率可达98.5％以上。