[发明专利]EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法

说明书

本发明涉及一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，包括如下步骤：步骤1：将含有EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液离心，取上清液；步骤2：将步骤1中收集的上清液用切向流超滤系统过滤浓缩，得浓缩液；步骤3：将步骤2中的浓缩液用阴离子交换层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液；步骤4：将步骤3中收集的洗脱峰溶液用肝素亲和层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液，即得所述EGF间充质干细胞外泌体。该方法能够特异性分离提纯EGF间充质干细胞外泌体，可有效分离携带EGF蛋白和未携带EGF蛋白的外泌体，提取的EGF间充质干细胞外泌体与传统超速离心方法相比，EGF蛋白含量更高，并且可以保持外泌体的完整性和生物学功能。

技术领域

本发明涉及外泌体提取分离技术领域，具体涉及一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法。

背景技术

间充质干细胞在再生医学领域具有重大应用前景，能够用于包括肝，心脏，骨骼，软骨，神经和皮肤在内的多种组织再生和治疗。间充质干细胞分泌的外泌体是一种纳米级的细胞外囊泡，属于间充质干细胞的旁分泌介质之一。外泌体能够将携带间充质干细胞中的miRNA和mRNA分子、多肽、蛋白质、细胞因子和脂质等功能性物质，可将这些内容物递送到受体细胞，发挥细胞通讯功能，调节受体细胞的生理功能，有助于受伤或患病组织和器官的愈合。在许多实验模型中都有报道间充质干细胞的治疗作用主要是由其分泌的外泌体发挥作用。因此，在再生医学领域，间充质干细胞来源的外泌体可以用于治疗各种疾病，例如：在皮肤伤口愈合中，其能够促进血管生成，减少炎症，促进皮肤细胞的增殖迁徙等。间充质干细胞来源的外泌体与间充质干细胞相比更稳定，能够减少给药活细胞的安全风险，例如具有低免疫原性，避免微血管阻塞风险等。除了上述提及的作用外，外泌体作为一种纳米级的脂质双分子囊泡还能够被分离并在低温条件下长期保存，不需要考虑成活率，体积微小容易循环，内容物稳定性较好。

生长因子EGF能刺激上皮细胞的增殖和迁移以及介导角质形成细胞向上皮细胞的分化进而促进伤口发生上皮化重建上皮屏障，在创伤愈合的过程中具有重要的作用。间充质干细胞来源的外泌体富含各种内容物，也包括生长因子EGF，但其一般表达于外泌体的膜内，EGF在外泌体中的含量较少，在受损部位中，外泌体携带的EGF虽然也能够被递送到受体细胞中发挥作用，但是由于是表达在膜内，因此EGF不能发挥特异靶向性作用，并且含量较低，其生物活性作用不是很显著。

CN113088496A公开了一种EGF间充质干细胞外泌体，EGF间充质干细胞外泌体是指通过基因工程改造后使间充质干细胞分泌的外泌体膜上锚定有EGF生长因子的外泌体。该EGF间充质干细胞外泌体的EGF表达量得到很大提高，此外由于EGF被表达在外泌体的细胞膜的表面，将这类EGF间充质干细胞外泌体递送到损伤组织，作用于该部位的多种细胞，能针对受损部位的肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞、上皮细胞、角质形成细胞以及表皮细胞等发挥特异性靶向作用，促进细胞的增殖迁徙，从而能够更好地促进损伤组织的愈合。

但是，目前针对EGF间充质干细胞外泌体还没有一种特异性的纯化方法，导致EGF间充质干细胞外泌体还无法得到大规模生产和应用。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，该方法实现了EGF间充质干细胞外泌体的特异性分离提纯，提取的EGF间充质干细胞外泌体与传统超速离心方法相比，EGF蛋白含量更高。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，包括如下步骤：

步骤1：将含有EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液离心，取上清液；

步骤2：将步骤1中收集的上清液用切向流超滤系统过滤浓缩，得浓缩液；

步骤3：将步骤2中的浓缩液用阴离子交换层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液；

步骤4：将步骤3中收集的洗脱峰溶液用肝素亲和层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液，即得所述EGF间充质干细胞外泌体。