[发明专利]EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法有效
申请号: | 202111509707.1 | 申请日: | 2021-12-10 |
公开(公告)号: | CN114134109B | 公开(公告)日: | 2023-01-24 |
发明(设计)人: | 邹衡芳;周晗;姚基祥;林菁华 | 申请(专利权)人: | 广州远想生物科技股份有限公司 |
主分类号: | C12N5/0775 | 分类号: | C12N5/0775 |
代理公司: | 广州广典知识产权代理事务所(普通合伙) 44365 | 代理人: | 曾银凤 |
地址: | 510335 广东省广州市海珠*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | egf 间充质 干细胞 外泌体 纯化 方法 | ||
1.一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:将含有EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液离心,取上清液;
步骤2:将步骤1中收集的上清液用切向流超滤系统过滤浓缩,得浓缩液;
步骤3:将步骤2中的浓缩液用阴离子交换层析柱分离纯化,收集洗脱峰溶液;
步骤4:将步骤3中收集的洗脱峰溶液用肝素亲和层析柱分离纯化,收集洗脱峰溶液,即得所述EGF间充质干细胞外泌体;
所述EGF间充质干细胞外泌体是指通过基因工程改造后使间充质干细胞分泌的外泌体膜上锚定有EGF生长因子的外泌体;
步骤1所述离心包括:先通过低速离心去除细胞,再通过高速离心去除细胞碎片和大颗粒杂质;所述低速离心的离心力为2500rpm~3500rpm,离心时间为20分钟~40分钟;所述高速离心的转速为8000rpm~10000rpm,离心时间为20分钟~40分钟;
步骤2所述切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为250KDa~350KDa;
步骤3所述阴离子交换层析柱中的层析介质为:Q Bestarose Fast Flow;
步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成:浓度为45mmol/L~55mmol/L 的Tris-HCl,浓度为0.08mol/L~0.12mol/L的NaCl,浓度为15mmol/L~25mmol/L的EDTA-2Na;步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为7.8~8.2;
步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成:浓度为45mmol/L~55mmol/L 的Tris-HCl,浓度为0.7mol/L~0.9mol/L的NaCl,浓度为15mmol/L~25mmol/L的EDTA-2Na;步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化中使用的洗脱液的pH为7.8~8.2;
步骤3所述用阴离子交换层析柱分离纯化的上样速度为1mL/min~2mL/min;所述用阴离子交换层析柱分离纯化采用梯度洗脱的方式进行洗脱,洗脱梯度为50%~100%,洗脱时间为20min~30min,洗脱流速为0.5~1.5ml/min;
步骤4所述肝素亲和层析柱的层析介质为Heparin Bestarose FF;
步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液由如下浓度的组分组成:浓度为18mmol/L~22mmol/L的磷酸盐缓冲液,浓度为0.5mol/L~0.7mol/L的NaCl,浓度为18mmol/L~22mmol/L的EDTA-2Na;步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的平衡液的pH为6.0~6.2;
步骤4所述用肝素亲和层析柱分离纯化中使用的洗脱液由如下浓度的组分组成:浓度为18mmol/L~22mmol/L的磷酸盐缓冲液,浓度为1.5~1.7mol/L的NaCl,浓度为18mmol/L~22mmol/L的EDTA-2Na。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法,其特征在于,步骤1所述离心包括:所述低速离心的转速为2900rpm~3100rpm,离心时间为28分钟~32分钟;所述高速离心的转速为8500rpm~9500rpm,离心时间为28分钟~32分钟。
3.根据权利要求2所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法,其特征在于,所述低速离心的离心力为3000rpm,离心时间为30分钟;所述高速离心的离心力为9000rpm,离心时间为30分钟。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的纯化方法,其特征在于,步骤2所述切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为300KDa。
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