[发明专利]基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法

说明书

本发明提供了基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法，涉及基因检测技术领域。本发明以三链DNA为信号扩增技术核心，将杂交链式反应(HCR)扩增和G‑四链体‑血红素DNA酶酶促信号扩增整合起来。在ctDNA存在的情况下，通过三链DNA引发多维网状杂交链式反应并形成三维立体网状DNA纳米线结构，此结构具有明显的细化分层及空间分布规律，支链上延伸出低层次分支，每个分支还可再延伸出更低层次的子分支。在此基础上，通过三链DNA介导构建分子间裂分式G‑四链体‑血红素DNA酶矩阵，从而实现循环核酸的超灵敏检测，具有无酶促信号扩增及可视化检测特征，具有极大发展潜力。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法。

背景技术

2020年全球新增癌症最多的是乳腺癌，同时2020年癌症导致的死亡病人约1000万人，其中乳腺癌死亡的病人达68.5万人。大部分乳腺癌患者在被发现时已是中、晚期阶段，其死亡率高达50％，而早期乳腺癌的长期治愈率可达90％以上。因此乳腺癌的早期发现、诊断和治疗是提高治愈率、降低死亡率的关键。

目前乳腺癌诊断方法主要有：钼靶检查、超声显像检查、活体组织检查、红外热图检测以及相关基因检测等方面，然而这些技术存在着对致密乳腺组织穿透力差、仪器装置笨重，扫描范围和方式受到限制，价格昂贵，或者具有侵袭性，不能准确追踪肿瘤的动态变化、数据缺少、灵敏度不够等困境。

近年来，循环肿瘤DNA(ctDNA)分析已成为非侵入性癌症诊断的趋势，也称为液体活检。ctDNA从肿瘤组织的凋亡、坏死肿瘤细胞或血液中循环的增生活跃肿瘤细胞(CTCs)释放到循环系统中，所以ctDNA携带与肿瘤一致的生物学信息。理论上是异质转移部位肿瘤DNA的混合体，可以更全面地描述肿瘤异质性。但是ctDNA在血液循环中浓度十分微量且以碎片化呈现，也是目前ctDNA检测所面临的主要挑战。

近年来新的分子生物学技术不断涌现，生物检测显示出仪器检查所不具备的优越性。基因治疗中反义基因技术利用形成三链DNA的寡核苷酸(triplex formingoligonucleotide,TFO)实现特异抑制基因表达，此项技术也被应用于循环肿瘤DNA检测领域。

G-四链体-Hemin DNA酶是近些年来迅速发展起来的一种DNA酶，具有易于复制和储存、价格低廉、便于特殊标记和操作、不易水解且热稳定性良好等优势。G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基(G)的DNA序列形成的一种特殊的DNA二级结构，当它们与氯化血红素(Hemin)结合后，可以显现出较强的过氧化物酶活性，能够催化H₂O₂参与的一些反应。目前，G-四链体-氯血红素DNA酶用于检测发展了多种生物传感器。虽然这类传感器弥补了传统仪器分析方法的不足，但仍然存在信号放大方法单一、灵敏度不足、背景值高、假阳性高等问题，在生物医学样品分析方面难以实现超灵敏序列检测。

杂交链式反应是2个DNA发夹之间的自组装杂交反应，在引发DNA存在时，通过部分互补序列重叠成一个长的双链DNA纳米线。由于不需要扩增DNA模板、信号放大不需要酶参与、假阳性率低等特点，该方法已经与多种技术相结合用于发展新型、高效生物传感器。目前存在的基因检测方法中许多新型生物传感器都具备良好的灵敏性，如：一种杂交链式反应和三链DNA支点超灵敏比色法检测循环肿瘤，检测限为0.1pM；一种基于碳点和DNA纳米树的荧光传感方法用于乳腺癌c-erbB2基因相关序列的检测，检测限为6aM；一种基于磁性复合探针解锁茎环结构的融合基因荧光分析方法检测，检测限为0.223pM。但由于血液中ctDNA的浓度过于微量，且血液环境复杂，影响因素众多，仍需寻找更好的兼具特异性、高灵敏度、操作简易、经济的新方法，当然也需要临床进一步的研究与实践。

发明内容