[发明专利]基于DNA三链介导构建多维DNA酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种基于三链DNA构建分子间裂分式G-四链体-血红素DNA酶矩阵的传感体系，其特征在于，所述传感体系包括6条寡核苷酸探针：捕获探针Capture、H1、H2、L3、L1和L2；

其中捕获探针Capture、H1、H2和L3均包含茎环发夹结构，且在每个所述茎环发夹结构中还包括引发信号放大的DNA序列，每个所述茎环发夹结构不发生杂交反应；

L1探针的核苷酸序列中包含15个碱基的相同嘧啶和一组GGG序列；

L2探针的核苷酸序列中包含15个碱基的相同嘧啶和三组GGG序列。

2.根据权利要求1所述的传感体系，其特征在于，所述捕获探针Capture的茎部为13个碱基、环部为11个碱基和单链末端为9个碱基；

H1和H2的茎部均为18个碱基、环部均为6个碱基和单链末端均为6个碱基；

L3的茎部为12个碱基、环部为4个碱基和单链末端为10个碱基。

3.权利要求1或2所述的传感体系在制备循环核酸检测试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述循环核酸包括循环肿瘤DNA。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，当所述循环肿瘤DNA为乳腺癌ctDNA时，所述捕获探针Capture的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述H1的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌ctDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

7.一种检测乳腺癌ctDNA的试剂盒，其特征在于，包括捕获探针Capture、H1、H2、L3、L1和L2，其中所述捕获探针Capture的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述L3的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述L2的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。

8.一种非诊疗目的的基于权利要求7所述试剂盒检测乳腺癌ctDNA的方法，包括以下步骤：(1)分别将所述捕获探针capture、H1、H2和L3加热到90℃孵育10min，梯度退火到25℃，分别得具有发夹结构的捕获探针capture、H1、H2和L3；

(2)将步骤(1)得到的所述具有发夹结构的捕获探针capture、H1、H2和L3与样本提取的ctDNA和Tris-Ac buffer混合成检测体系，37℃下孵育3h，而后30℃孵育4h，得孵育液；

(3)将步骤(2)所述孵育液与L1、L2、Tris-Ac buffer和hemin混匀，25℃下孵化1h，得反应液；

(4)将步骤(3)所述反应液与ABTS^2-和H₂O₂混合均匀后，25℃孵育8min，进行比色，当有绿色产生时表明所述样本中包含乳腺癌ctDNA。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述检测体系以20μL计，包括：0.4μL ctDNA、1.2μL捕获探针Capture、1.2μL H1、1.2μL H2、0.8μL L3和15.2μL Tris-Acbuffer。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育液与L1、L2、Tris-Acbuffer和hemin的体积比为20：6：6：16：2。