[发明专利]一种同时制备ERN-T和ILV-T的方法

说明书

本发明提供了一种同时制备ERN‑T和ILV‑T的方法。该方法首先用表达人源TRAIL蛋白的病毒转染传代至第2～4代的细胞，破碎、离心，分离上清液，通过蔗糖密度梯度离心至分层，自上往下第二层即为ERN‑T，第三层即为ILV‑T。本发明首次提供了一种可同时制备两种纳米TRAIL制剂(ERN‑T和ILV‑T)的方法，提高了TRAIL工程化细胞的利用率；且该方法操作简单，成本低，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于抗癌生物纳米制剂制备技术领域。更具体地，涉及一种同时制备ERN-T和ILV-T的方法。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumour Necrosis Factor-RelatedApoptosis-Inducing Ligand，TRAIL)通过与多种癌细胞表面的死亡受体TRAILR1/DR4和TRAILR2/DR5结合，募集胞浆内接头蛋白FADD和半胱天冬酶原8(Procaspase-8)，形成一个死亡诱导信号复合体(DISC)，激活Procaspase-8，进而诱导Procaspase3的激活，启动细胞外源凋亡通路，引起细胞凋亡。此外，TRAIL还能激活线粒体介导的半胱天冬酶9(caspase-9)相关的细胞内源凋亡通路，即激活的caspase-8切割激活BID为tBID，后者结合到线粒体膜，降低线粒体的膜电势，促使线粒体释放细胞色素c和Smac/DIABLO，两者协同激活caspase-9，与caspase-8一起激活凋亡效应酶caspase-3，引起细胞凋亡。TRAIL通常只作用于肿瘤或癌细胞引发凋亡，对正常细胞没有影响，安全性好，因此具有良好的抗癌应用前景。

然而，目前重组可溶型TRAIL(rTRAIL)的临床试验效果很不理想，虽然安全性没有问题，但治疗几乎无效。主要原因可归纳为几点：1)rTRAIL的凋亡诱导活性不高；2)肿瘤细胞普遍存在对rTRAIL的耐药性；3)rTRAIL在体内不稳定，半衰期只有30min，生物利用度低；4)rTRAIL缺乏对癌症和肿瘤的靶向性。因此，研发新型高效的TRAIL制剂，以期实现这一促凋亡因子的临床应用成为了一个迫切的研究课题。近期(2021年6月)Hou Huan等公开了一种制备内质网源纳米TRAIL(ERN-T)的方法，但该方法只分离制备得到一种膜结合纳米TRAIL——ERN-T(Hou Huan et al.TRAIL-Armed ER Nanosomes Induce DrasticallyEnhanced Apoptosis in Resistant Tumor in Combination with the Antagonist ofIAPs(AZD5582)(Advanced Healthcare Materials,2021,10(11))。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种可同时制备两种纳米TRAIL制剂：ERN-T(内质网来源的纳米TRAIL)和ILV-T(表达TRAIL的多囊泡体腔内囊泡)的方法，提高了TRAIL工程化细胞的利用率。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种同时制备ERN-T和ILV-T的方法，包括如下步骤：

S1.用表达人源TRAIL蛋白的病毒转染传代至第2～4代的细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的细胞，破碎得到细胞匀浆液；

S2.将步骤S1所得细胞匀浆液离心、分离上清液，再通过蔗糖密度梯度离心至分层，自上往下第二层即为ERN-T，第三层即为ILV-T；

其中，所述细胞包括脐带间充质干细胞(MSC)、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、心肌细胞、人胚肾细胞、巨噬细胞、T细胞、肿瘤相关成纤维细胞中的一种或几种。

最优选地，所述细胞为脐带间充质干细胞。

优选地，步骤S1所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒中的一种或几种。