[发明专利]利用重组毕氏酵母表达诱抗蛋白的方法

说明书

本发明属于生物技术领域。为提高毕氏酵母表达诱抗蛋白的通量，提供一种利用重组毕氏酵母表达诱抗蛋白的方法，包括以下步骤：将毕氏酵母工程细胞株GS115/pPIC9k‑Elicitin在YPDA的平板上划线培养；挑取单菌落接种于BMGY或BMMY培养基中，pH 5‑8，振荡培养至对数生长期；室温下，离心，收集酵母细胞，弃上清；将酵母细胞重悬于所述培养基中，继续培养并加入甲醇至终浓度为0.25％‑1.5％；每隔一段时间补加甲醇以维持诱导，诱导表达2d‑5d，将发酵液室温下离心，在上清液中加入硫酸铵，沉淀蛋白，离心，沉淀用PBS溶液回溶。本申请提供的方法，可以快速、高效、批量地生产大量诱抗蛋白溶液。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用重组毕氏酵母表达诱抗蛋白的方法。

背景技术

诱抗蛋白作为一种新型的生物农药，已经开始应用于防治植物病害，不仅有很好的防治效果，同时也可以解决化学农药的弊端。诱抗蛋白可以使植物产生诱导抗病性，这种诱导抗病性具有抗病时间长、表达空间可控等特点，而且对人体健康与环境安全都不会造成威胁，所以植物诱导抗病性具有良好的应用前景。然而，目前诱抗蛋白的批量生产是制约其应用于农业生产的重要瓶颈，因此利用转基因技术建立一种快速、高效生产诱抗蛋白的技术迫在眉睫，这对研究诱抗蛋白在实际生产中对植物抗病促生的作用效果，实现病害防治的环保、高效意义重大。

毕氏酵母(毕赤酵母)表达系统由于具有能够分泌表达目的蛋白质，且能进行翻译后加工等特点而成为首选的真核表达系统。然而用毕氏酵母表达目的蛋白，由于表达条件的不同，其表达量通常会有很大差别，而低表达量对工业化生产极为不利。

发明内容

本发明的目的旨在解决毕氏酵母表达目的蛋白的表达通量较低的问题，提供一种利用重组毕氏酵母表达诱抗蛋白的方法，该方法能够快速、高效、批量地生产诱抗蛋白。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用重组毕氏酵母表达诱抗蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将毕氏酵母工程细胞株GS115/pPIC9k-Elicitin在YPDA的平板上划线进行纯培养；

(2)挑取单菌落接种于BMGY或BMMY培养基中，所述BMGY或BMMY培养基的pH为5-8，于28-30℃振荡培养至对数生长期OD600＝2-6；

(3)室温下，离心，收集酵母细胞，弃上清；

(4)将酵母细胞重悬于BMGY或BMMY培养基中，至OD600为1.0-2.0，于28-30℃继续培养并加入100％的甲醇至甲醇终浓度为0.25％-1.5％；

(5)每隔一段时间补加100％的甲醇至终浓度为0.25％-1.5％以维持诱导，诱导表达2d-5d，将发酵液室温下离心，在上清液中加入硫酸铵至饱和度80％，沉淀蛋白，离心，沉淀用PBS溶液回溶，用PBS溶液透析除盐后即可得大量的粗蛋白液。

进一步的，所述步骤(4)甲醇终浓度为0.5％-1.25％。

进一步的，所述步骤(4)甲醇终浓度为1.0％。

进一步的，所述BMGY或BMMY培养基的pH为5.5-7.0。

进一步的，所述BMGY或BMMY培养基的pH为6.0。

进一步的，所述步骤(5)诱导表达4d。

进一步的，所述步骤(2)振荡培养的条件为30℃，200rpm，16-18h。

进一步的，所述步骤(3)室温下，4000rpm离心5min。

进一步的，所述步骤(4)诱导培育的温度为30℃。

进一步的，所述步骤(5)每隔24h补加100％的甲醇。