[发明专利]一种通过基因编辑技术创制西瓜全缘叶种质的方法

说明书

本发明公开了一种通过基因编辑技术创制西瓜全缘叶种质的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明首次利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，对HD‑ZIP转录因子Cla97C04G076510或其保守结构域进行基因编辑敲除，使得该基因功能缺失或者出现突变，从而形成全缘叶片表型西瓜种质。通过本方法创制的西瓜叶片全缘系与正常的材料相比，除了叶片形状不同外，其他组织如根、茎、卷须、雌花、雄花、生长势等都无可见表型变化；如果将创制的西瓜全缘种质用于杂交种生产或群体改良，将对西瓜商品杂交种纯度的鉴定及改良西瓜叶型具有重要意义。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种通过基因编辑技术创制西瓜全缘叶种质的方法。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)，为葫芦科(Cucurbitaceae)西瓜属(Citrullus)，是世界上种植比较广泛的一种重要的葫芦科作物，更是一种水果型经济作物，因其种植面积和年消费量而被评为世界第五大水果。目前，商品种杂交纯度的鉴定一直是我国西瓜产业中亟待解决的技术难题，若无法及时地把母本自交苗从杂交苗中去除，将会给西瓜生产带来严重损失。

西瓜叶形变异作为一种理想形态标记，可用于直观、快速、准确的鉴定杂交种的纯度，降低伪杂种在作物生产中带来的损失。目前，在其他作物中叶缘裂刻基因功能有相关报道，包括油菜叶缘裂刻基因(BnLL1)；羽衣甘蓝控制裂叶关键基因(Bo9g184610)；拟南芥叶缘裂刻相关基因(LMI1)等。西瓜的裂叶基因还未见基因功能鉴定的报道。

因此，提供一种通过基因编辑技术创制西瓜全缘叶种质的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种通过基因编辑技术创制西瓜全缘叶种质的方法，利用CRISPR/Cas9编辑系统对西瓜HD-ZIP转录因子Cla97C04G076510进行编辑，创制全缘叶种质。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种通过基因编辑技术创制西瓜全缘叶种质的方法，具体步骤如下：

(1)根据Cla97C04G076510的CDS序列设计基因编辑的靶位点，包含两个靶点Target1和Target2；

Target1序列：5’-GTGGAAGGTGAACAAAGTA-3’；SEQ ID NO.2；

Target2序列：5’-GCTAAGAGAACAAGCAACG-3’；SEQ ID NO.3；

(2)构建CRISPR/Cas9编辑载体

①以中间载体pCBC-DT1T2为模板，利用引物Target1F/Target2R进行PCR扩增，回收目的片段；

②利用限制性内切酶BsaI-HF对CRISPR/Cas9载体pBSE402进行酶切，回收酶切后的载体pBSE402；

③将步骤①回收的目的片段与步骤②酶切后的载体pBSE402进行同源重组连接，获得连接产物；

④将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，经测序正确，抽提重组质粒，转化至农杆菌感受态细胞EHA105；

(3)西瓜遗传转化

经验证正确后，用于西瓜遗传转化，获得基因编辑植株Cla97C04G076510-CR。

进一步，步骤(2)①所述引物Target1F/Target2R序列如下：

Target1F：5’-TTCTAGCTCTAAAACTACTTTGTTCACCTTCCACCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’；SEQ ID NO.4；