[发明专利]一种高效生产甘油的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种高效生产甘油的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明在大肠杆菌中强化表达优化密码子后的3‑磷酸甘油脱氢酶和3‑磷酸甘油酶，构建了基因工程菌，在使用该工程菌以葡萄糖为底物发酵生产甘油时，极大地提高了甘油的产量，尤其是重组大肠杆菌E.coli Rosetta/pRSFduet‑gpd1o‑gpp2o在1L发酵罐中甘油产量达到了10.89g/L，在摇瓶发酵中甘油产量达到了6.816g/L，相较于表达未优化密码子的3‑磷酸甘油脱氢酶和3‑磷酸甘油酶的对照菌株E.coli BL21(de3)/pRSFduet‑gpd1‑gpp2的摇瓶发酵来说，甘油产量提高了58倍。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效生产甘油的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

甘油又称1,2,3-丙二醇，是无色无味的有机液体，除了用作汽车和飞机燃料以及油田的防冻剂，在食品、造纸、化妆品、制革、纺织、照相、印刷、金属加工、电工材料和橡胶等工业中都有着广泛的用途，也可作为生产各种化学品的原料。此外，它也被认为是工业发酵的原料，主要通过微生物发酵生产一些高附加值的产品，例如黄原胶，海藻糖，鼠李糖脂，柠檬酸，乳酸，DHA，EPA，1,3-丙二醇等，其中1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)作为新型高分子材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的纤维单体，就是比较经典且具优势的产品之一。PTT纤维，综合了尼龙的柔软性、腈纶的蓬松性、涤纶的抗污性,加上本身固有的弹性，以及能常温染色等特点，把各种纤维的优良服用性能集于一身,成为当前国际上最新开发的热门高分子新材料之一。据有关专家估计，PTT纤维的需求量大约55％来自地毯领域，其余的45％为其他纺织品领域。但目前PTT的市场价格偏高，因而限制它只能在成本消化能力较强的产品和品种方面取得有限的发展成果，因此通过微生物发酵法合成PTT纤维单体1,3-丙二醇成为目前国内外学者研究的一个热点。

此外，1,3-PD独特的物理性质使其本身就是一种良好的溶剂、保护剂、抗冻剂，在1998年就已被美国食品药物管理局(FDA)认定为GRAS(美国FDA使用的检验标记，表示食品安全可用)，在食品领域可作为乳化剂、调味剂、增稠剂、保鲜剂、添加剂和吸湿剂等，不仅能改善食品的感官质量，提高食品的耐藏性和稳定性，同时也可以大大提高食品的营养价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效生产甘油的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明在大肠杆菌中通过EMP途径利用底物葡萄糖产生中间产物磷酸二羟丙酮，引入来自酿酒酵母的两个密码子经过优化设计后的关键酶3-磷酸甘油酶和3-磷酸甘油脱氢酶，将其过表达，实现磷酸二羟丙酮向甘油的转变，从而构建利用葡萄糖产甘油的通路。

本发明的技术方案如下：

一种高效生产甘油的基因工程菌，所述基因工程菌同时强化表达优化密码子后的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酶。

根据本发明优选的，所述基因工程菌为重组的大肠杆菌，所述大肠杆菌为E.coliBL21(de3)、E.coli BL21(star)或E.coli Rosetta。

根据本发明优选的，所述3-磷酸甘油脱氢酶为来自酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶，其编码基因为gpd1o，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酶的密码子经过优化设计，使其更适应大肠杆菌。

根据本发明优选的，所述3-磷酸甘油酶为来自酿酒酵母的3-磷酸甘油酶，其编码基因为gpp2o，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。该酶的密码子经过优化设计，使其更适应大肠杆菌。

根据本发明优选的，所述基因工程菌构建所用的表达载体中3-磷酸甘油脱氢酶基因位于3-磷酸甘油酶的上游。

根据本发明优选的，所述基因工程菌为重组的E.coli BL21(de3)时，还在基因工程菌中插入分子伴侣1和分子伴侣2。