[发明专利]一种制备抗新冠病毒全人源Ab2β抗体自复制型DNA方法

权利要求书

1.一种制备抗新冠病毒全人源Ab2β抗体自复制型DNA方法

本发明涉及制备一种抗新冠病毒全人源Ab2β抗体自复制型DNA的方法，把目前基因疫苗中的“S蛋白换成Ab2β抗体”。唯一目的：预防新冠病毒感染。

11..目前世界抗新冠病毒或其变异体的药物现状。

1.1.1.小分子化学药

包括辉瑞的3CL蛋白酶抑制剂在内的所有化学药：(1)都是抑制不是消灭。(2)都是治疗不是预防。

1.1.2..高效中和抗体

1.1.2.1.有的高效中和抗体由于抗原表位突变失去作用或者由于抗体，补体，构象变异导致ADE效应。

1.1.2.2.高效中和抗体和Ab2β抗体都是治疗药不是预防药。

1.1.3..疫苗

1.1.3..1.不少国家都在研制DNA疫苗。

1.1.3.2..《自然杂志》：全球印度首个批准的人用DNA疫苗(质粒)。DNA不能通过细胞核孔，需要专用电脉冲注射器。中外都有DNA质粒疫苗研制，早在90年代美国大学在小鼠肌肉内注射外源基因重组质粒，质粒稳定表达蛋白质至少2个月，小鼠寿命2年，相当人的肌肉组织细胞七年。中国农科院哈尔滨畜牧兽医研制预防禽流感DNA疫苗(2018年获得国家新药证书)。

1.2.理论依据

1..2.1.特殊的Ab2β抗体的作用和用途及其广泛。

1.2.2..所有教科书：如《细胞和分子免疫学》第三节：抗独特型抗体……在研究中应用。简单陈述，即具有靶细胞ACE2受体抗原内影像的Ab2β抗体，具有ACE2受体抗原相似的氨基酸排列顺序或空间构型(任何中和抗体也没有这种相似的氨基酸排列顺序或空间构型)，所以Ab2β抗体能够模拟ACE2受体抗原的作用形成，新冠病毒氨基酸-互补结合-Ab2β抗体氨基酸-互补结合-Ab1抗体氨基酸-互补结合-靶细胞ACE2受体氨基酸位点结合链。有理论和试验证明这种链式免疫亲和力高。本发明Ab2β抗体可以代表ACE2受体全方位结合新冠病毒并消灭之。

1.2.3..基因疫苗和全人源Ab2β抗体自复制型DNA

1.2.1.4..有关辉瑞和moderna的mRNA疫苗，世卫组织和世界著名期刊一年多来都有大量报道，无需赘言。

1.2.1.5.DNA疫苗，病毒基因复制性疫苗，自扩增mRNA疫苗和本人另一个发明专利申请Ab2β抗体mRNA。从时间维度看，虽然可以长时间持续分泌S蛋白或Ab2β抗体，但毕竟有病毒成分，也会被免疫识别消灭。肯定不如全人源Ab2β抗体自复制型模板单链DNA生产的产物Ab2β抗体，无毒副作用。都经过人的胚胎期天然免疫耐受。

1.2.1.6..DNA疫苗

全人源Ab2β抗体自复制型DNA，生产的Ab2β抗体会更加持久，根本不用担心Ab2β抗体水平的长期的预防作用，哪怕是较低水平。Ab2β抗体全方位中和新冠病毒。

1.2.1.7..RNA依赖性的RNA聚合酶(一般是RNA病毒核糖核酸编码)。

1.2.1.8.人DNA依赖性的RNA聚合酶和转录因子。转录因子和RNA聚合酶先后识别组织特异性启动子。

1.2.1.9.人DNA依赖性的DNA聚合酶和DNA解旋酶。

1.2.10.人细胞核孔特异性识别序列-核输出NES和核定位NLS信号进出核孔。

1.2.11..《自然杂志》：全球首个批准的人用DNA疫苗(质粒)。DNA不能通过细胞核孔。中外都有DNA质粒疫苗，90年代美国大学就把目的蛋白质抗原质粒DNA注射小鼠肌肉，抗原稳定表达两个月，小鼠寿命2年；中国农科院哈尔滨畜牧兽医研制预防禽流感DNA疫苗(获得国家新药证书)。

1.2.12..人肌肉细胞质(线粒体)存在DNA依赖性RNA聚合酶和转录因子等物质。

1.3.接种肌肉细胞的两条不同技术路线的实验方案(先动物后人)

1.3.1.首先说明制备抗新冠病毒Ab2β抗体，这是制备全人源Ab2β抗体DNA的关键(两者就是同一基因序列)。

1.3.2.材料：肺腺癌或人细支气管2型肺泡癌细胞和携带上皮组织细胞；肾癌手术切除后的肿瘤和携带正常组织。青春期纯系鼠几十只。

1.3.3.脂质纳米颗粒包裹模板单链DNA实验方案

1.3.3.1.人体肌肉细胞核孔特异性识别：“脂质纳米颗粒包裹伪装mRNA进入肌细胞核孔特定序列(核输出NES和核定位NLS信号进出核孔)-连接-DNA-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肌细胞启动子序列-连接-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肝细胞启动子序列-全人源Ab2β抗体自复制型DNA-连接-白蛋白内含子。如果下游肝细胞启动子转录水平下降，可在两个启动子中间插入一个转录终止子。可以携带几个全人源Ab2β抗体模板单链DNA进入肌细胞核。

1.3.3.2.脂质纳米颗粒包裹DNA-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肌细胞启动子序列-连接-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肝细胞启动子序列-全人源Ab2β抗体自复制型DNA-连接-白蛋白内含子。可以携带几个全人源Ab2β抗体模板单链DNA进入肌细胞质。

1.3.3.3.静脉注射途径，人体肝细胞核孔特异性识别：“脂质纳米颗粒包裹伪装mRNA进入肝细胞核孔特定序列(核输出NES和核定位NLS信号进出核孔)-连接-DNA-肝细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肝细胞启动子序列-连接-全人源Ab2β抗体自复制型DNA-连接-白蛋白内含子。可以携带几个全人源Ab2β抗体模板单链DNA进入肝细胞核。

1.3.3.4.静脉注射途径：脂质纳米颗粒包裹DNA-肝细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肝细胞启动子序列-连接——全人源Ab2β抗体自复制型DNA-连接-白蛋白内含子。可以携带几个全人源Ab2β抗体模板单链DNA进入肝细胞质。

1.4.质粒外源基因重组DNA实验方案

常用商业化质粒载体：如E.coli(大肠杆菌)选择最适合质粒连接下面全人源Ab2β抗体自复制型DNA。

1.4.1.把含有DNA-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肌细胞启动子序列-连接-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肝细胞启动子序列-全人源Ab2β抗体自复制型DNA-连接-白蛋白内含子质粒。通过电脉冲细胞打孔特殊装置把肌细胞打孔，质粒进入肌细胞，再进入肌细胞核。

1.4.2.把含有DNA-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肌细胞启动子序列-连接-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肝细胞启动子序列-全人源Ab2β抗体自复制型DNA-连接-白蛋白内含子质粒。通过电脉冲细胞打孔特殊装置把肌细胞打孔，质粒进入肌细胞质。

1..5.肌肉组织细胞内脂质纳米颗粒和质粒DNA实验方案

1..5.1.人体肌肉细胞核孔特异性识别：“脂质纳米颗粒包裹伪装mRNA进入肌细胞核孔特定序列(核输出NES和核定位NLS信号进出核孔)-连接-DNA-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肌细胞启动子序列-全人源Ab2β抗体自复制型DNA。可以携带几个全人源Ab2β抗体模板单链DNA进入肌细胞核。

1.5.2.脂质纳米颗粒包裹DNA-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肌细胞启动子序列-连接-全人源Ab2β抗体自复制型DNA。可以携带几个全人源Ab2β抗体模板单链DNA进入肌细胞质。

1.5.3.把含有DNA-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肌细胞启动子序列-连接-全人源Ab2β抗体自复制型DNA质粒。通过电脉冲细胞打孔特殊装置把肌细胞打孔，质粒进入肌细胞，再进入肌细胞核。

1.5.4.把含有DNA-肌细胞转录因子和增强子结合序列-RNA聚合酶识别肌细胞启动子序列-连接-全人源Ab2β抗体自复制型DNA质粒。通过电脉冲细胞打孔特殊装置把肌细胞打孔，质粒进入肌细胞。

1.6.实验方案应用肌肉组织细胞和白蛋白内含子的意义

1.6.1.应用肌肉组织细胞的意义

根据专家论点：自扩增外源基因产物分泌蛋白质如全人源Ab2β抗体，可以在人体表达一个细胞周期的时间。人体细胞更新周期：接种肌肉组织2-3年；皮肤细胞4-6月(也有报道28天)；肝细胞半年；T细胞可达几年。所以选择肌肉组织细胞。但任何细胞都处在(1)静止干细胞期。(2)细胞分裂期。(3)未成熟细胞期。(4)成熟细胞期。(5)细胞凋亡期。如果目的外源基因接种细胞凋亡期，自扩增更新周期时间就很短了。因此皮内注射更易于接触表皮干细胞。

1.6.2.白蛋白内含子的意义

肝细胞一生都在持续产生大量白蛋白，但肝细胞功能太大，分裂很快，不适于导入本发明外源基因，原因毒副作用。治疗性干细胞除外。

1.6.3.如果肌肉组织RNA聚合酶不能识别肝细胞特异性启动子，则把肝细胞启动子换成组成型启动子。

1.7..发现和发明。教科书：骨骼肌肌肉细胞(肌纤维)是由成肌细胞融合而成，因此骨骼肌纤维有多个细胞核和大量线粒体，可供复制DNA。肌肉细胞直径50微米，长度几毫米-几十厘米。大肠杆菌质粒50纳米；酵母质粒2微米。在没有肌肉特殊电脉冲打孔装置或数量少情况下：

1.7.1.最好方法是选三角肌，通过注射全人源Ab2β抗体自复制型DNA.沿着三角肌最大斜面缓缓注射到肌肉深处，然后缓缓拔出来或者不拔出来，换一个方向再次缓缓注射肌肉深处。

1.7.2.利用晶体高渗透压把质粒送进三角肌肉细胞内。

1.8.动物试验

纯系青春期鼠或兔子试验：将肌肉组织转录因子和肌肉组织细胞启动子，改换成组成型启动子(规避种属差异)。利用鼠或兔子自身转录因子和RNA聚合酶，进行完整3.“接种肌肉细胞的两条不同技术路线的实验方案(先动物后人)”不再重复该过程。

1.9.本发明全人源Ab2β抗体与对照组比较试验

1.9.1.任何疫苗诱导纯系青春期鼠或兔子和本发明全人源Ab2β抗体DNA产生的抗体。动物和人之间进行产生抗体阻断能力比较试验。在同时接种任何疫苗和全人源Ab2β抗体DNA，7天后制备同等量抗血清，在体外进行阻断新冠病毒与人细支气管2型肺泡癌细胞或上皮细胞结合试验。30天后再重复上述抗血清阻断……试验。60天后再次重复上述抗血清……试验。观察特别是预防作用试验效果。

1.9.2.任何疫苗诱导人免疫系统和本发明全人源Ab2β抗体DNA产生的抗体。两者之间进行产生抗体阻断能力比较试验。在同时接种任何疫苗和全人源Ab2β抗体DNA，7天后制备同等量抗血清，在体外进行阻断新冠病毒与人细支气管2型癌细胞或上皮细胞结合试验。30天后再重复上述抗血清阻断……试验。60天后再次重复上述抗血清……试验。观察特别是预防作用试验效果。

1.10..本发明创新点

1.11..利用人体肌肉组织细胞本身的转录因子和增强子与RNA聚合酶。

1.12.利用人体肌细胞转录因子，增强子和肝细胞启动子以及白蛋白内含子。

1.13.伪装人体mRNA特定识别序列(核输出NES和核定位NLS信号进出核孔)，携带全人源Ab2β抗体DNA通过细胞核孔。

1.14.备案，假设肝细胞启动子阻止RNA聚合酶识别，可以改成组成型启动子。

8.5.本发明与接种灭活疫苗，相辅相成。

1.15.预期成果和作用：

1.15.1.预期成果：

提供不同来源全人源Ab2β抗体DNA的正确基因序列。制备Ab2β抗体DNA的过程，完全利用通用的mRNA技术和质粒DNA技术的混合再创新制备过程。

1.15.2.预期预防作用：

1.15.3..制备抗新冠病毒全人源Ab2β抗体自主复制型DNA，把任何疫苗之中的S蛋白换成了全人源Ab2β抗体。可以让接种全人源Ab2β抗体自主复制型DNA的人，都产生外源(外因或外力)Ab2β抗体。

1.15.4.当Ab2β抗体在肌肉细胞长期不断产生之时，即长期预防的的本发明研制成功。

1.16.比较S蛋白基因疫苗和全人源Ab2β抗体自主复制型DNA的不同点

1.16..1.以同样方式接种者在体内的mRNA有效率和有效力完全不同。

1.16..2.特别是出现各种变异新冠病毒后。接种S蛋白mRNA或质粒DNA疫苗，由于人群免疫应答能力不同，所以免疫效果不同。因此，预防的有效率与有效力评估差异很大。

1.16.3.接种Ab2β抗体DNA，每个人体内都产生同样的Ab2β抗体，应对新冠病毒。

1.17.可以利用人或动物的组成型启动子，重复《接种肌肉细胞的两条不同技术路线的实验方案(先动物后人)》，接种动物和人的不同部位和组织。

1.18..一种制备抗艾滋病毒全人源Ab2β抗体自主复制型DNA的方法

1.18.1.技术路线

艾滋病毒-互补结合-Ab2β抗体氨基酸-互补结合-Ab1抗体氨基酸-互补结合-靶细胞CD4受体氨基酸

1.19.2.可以参照接种肌肉细胞的两条不同技术路线的实验方案或直接选择CD4细胞试验(先动物后人)。

1.20..一种制备抗乙肝病毒全人源Ab2β抗体自主复制型DNA的方法

1.20.1.技术路线

乙肝病毒-互补结合-Ab2β抗体氨基酸-互补结合-Ab1抗体氨基酸-互补结合-靶细胞受

1.20.2.目前清华大学李文辉研究员发现，钠离子-牛黄胆酸共转运蛋白(NTCP)是靶细胞受体。利用乙肝如果有乙肝病毒灭活疫苗，可以在不接触乙肝病毒的情况下，获得Ab2β抗体。确证钠离子-牛黄胆酸共转运蛋白(NTCP)或者还有其它受体。

13.3.可以参照接种肌肉细胞的两条不同技术路线的实验方案(先动物后人)，制备全人源Ab2β抗体，静脉注射，全人源Ab2β抗体自主复制型DNA60％-80％到达肝脏。

1.21..本发明只采用基因工程四步奏中的前两步骤。本发明有其它方法对表达目的产物Ab2β抗体进行鉴定。